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PCR:聚合酶聯式反應

  聚合酶聯式反應(PCR)是分子生物學用于創建特定DNA片斷的多個副本技術。該技術由美國生物學家KaryMullis1983年開發。PCR使得生成一小段DNA的數百萬個副本可能。該工具通常用于生物分子學和生物技術實驗室。

  PCR原理

  PCR技術基于DNA的酶促復制。在PCR中,使用引物介導的酶擴增短片段DNADNA聚合酶 合成與模板DNA互補的新DNA鏈。DNA聚合酶只能將核苷酸添加到預先存在的3'-OH基團上。因此,需要引物。因此,更多的核苷酸被添加到DNA聚合酶的3'引物端。

PCR

  PCR的組成部分

  PCR的組成部分如下:

  DNA模板——樣本中感興趣的DNA

  DNA聚合酶–使用Taq聚合酶。它具有熱穩定性,在極高溫度下也不會變性。

  寡核苷酸引物-這些是與正義鏈和反義鏈的3'端互補的短單鏈DNA

  脫氧核糖核苷酸三磷酸–為聚合提供能量,是DNA合成的基石。它們是堿基的單一單位。

  緩沖系統–鎂和鉀為DNA變性和復性提供最佳條件。它對保真度、聚合酶活性和穩定性也很重要。

  PCR類型

  PCR有以下類型:

  1.實時PCR

  在此類型中,DNA擴增是借助熒光報告基因實時檢測的。熒光報告基因的信號強度與擴增的DNA分子數量成正比。

  2.嵌套PCR

  這是為了提高靈敏度和特異性。它們減少了由于意外引物結合位點擴增而導致的產品非特異性結合。

  3.多重PCR

  它用于在單個PCR實驗中擴增多個目標。它可以同時擴增許多不同的DNA序列。

  定量PCR

  它利用DNA擴增線性來檢測、表征和量化樣本中的已知序列。

  4.任意引物PCR

  這是一種基于PCRDNA指紋識別技術,使用任意選擇的DNA序列的引物。

  PCR步驟

  PCR涉及三個主要循環反應:

  1.變性

  當反應混合物加熱至94℃并持續約0.52分鐘時,就會發生變性。這會破壞兩條DNA鏈之間的氫鍵,并將其轉化為單鏈DNA

  單鏈現在充當模板,用于產生新的DNA鏈。應提供更長時間的溫度,以確保兩條鏈分離。

  2.退火

  反應溫度降至54-60℃,持續約20-40秒。此時引物與模板DNA上的互補序列結合。

  引物是長度約為2030個堿基的DNARNA單鏈序列。

  它們是DNA合成的起點。

  兩條分離的鏈以相反的方向運行,因此有兩個引物——正向引物和反向引物。

  3.伸長

  此步驟中,溫度升至72-80℃,利用Taq聚合酶將堿基添加到引物的3'端。

  這會使DNA5'方向延伸至3'方向。DNA聚合酶在最佳條件下每分鐘增加約1000bp

  Taq聚合酶可以耐受極高的溫度。它附著在引物上,并將DNA堿基添加到單鏈上。結果,獲得了雙鏈DNA分子。

重復這三個步驟20-40次,以便在很短的時間內獲得大量感興趣的DNA序列。

上述是聚合酶鏈式反應(PCR)介紹,PCR在科研、醫學和藥品廣泛應用,通過了解PCR及原理,用我們專業的PCR技術為科研貢獻一份力量。

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