細(xì)胞計數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)比較關(guān)鍵步驟，通過細(xì)胞計數(shù)，用于確定細(xì)胞數(shù)量，判斷細(xì)胞數(shù)量是否滿足實驗需求。細(xì)胞計數(shù)有人工手動計數(shù)、自動細(xì)胞計數(shù)儀法等，目前實驗室較為常用的細(xì)胞計數(shù)法是在顯微鏡下使用血細(xì)胞計數(shù)板人工計數(shù)。

  細(xì)胞計數(shù)操作步驟

  一、準(zhǔn)備好血細(xì)胞計數(shù)板

  首先，用無水乙醇清潔血細(xì)胞計數(shù)板表面和蓋玻片；

  其次，再用純水清潔血細(xì)胞計數(shù)板表面和蓋玻片；

  接著，清洗后用洗耳球吹干；

  最后，在血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)池上方蓋上專用的玻璃片。

  注意事項：在上述清洗過程，最好不要觸碰血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)池，避免標(biāo)示線損壞。

  二、制備細(xì)胞懸浮液

  貼壁生長的細(xì)胞，使用胰酶消化使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫落；

  旋渦混均或使用移液器反復(fù)吹細(xì)胞懸浮液，盡量減少細(xì)胞團(tuán)簇；

  懸浮細(xì)胞則可以直接進(jìn)行取樣計數(shù)；

  細(xì)胞懸液的計數(shù)濃度通常建議在 5×10?個細(xì)胞/mL到5×10?個細(xì)胞/mL 之間。

  注意事項：盡量減少細(xì)胞團(tuán)簇；

  如需計算活率，則許按1:1的比例混合細(xì)胞懸液和0.4%臺盼藍(lán)染液，輕輕混勻，靜置1-2分鐘，使染料充分進(jìn)入細(xì)胞。

  三、細(xì)胞加樣

  移液器輕吹細(xì)胞懸浮液使其混合均勻；

  將細(xì)胞懸浮液與臺盼藍(lán)染料按1:1體積混合均勻；

  取出10uL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液滴加于血細(xì)胞計數(shù)板邊緣凹槽處，此時液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計數(shù)池。

  注意事項：

  每次加樣前要混均細(xì)胞懸浮液，防止細(xì)胞沉降造成取樣誤差增大；

  在加樣過程，要一次性將細(xì)胞懸液注入計數(shù)室，防止氣泡產(chǎn)生，否則要重做；

  加樣時不要將細(xì)胞懸浮液直接吹入計數(shù)池，會造成細(xì)胞分布不均勻。

  四、人工細(xì)胞計數(shù)

  主要的計數(shù)工具：10X物鏡的顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板。

  加樣后，將血細(xì)胞計數(shù)板靜置2-3分鐘；

  把血細(xì)胞計數(shù)板放置在顯微鏡的載物臺進(jìn)行觀察，記錄和計數(shù)；

  分別計數(shù)大方格1，2,3,4中細(xì)胞總數(shù)。

  注意事項：

  計數(shù)時，建議重復(fù)1-2次，取平均值，減小計數(shù)誤差；

  4個區(qū)域細(xì)胞的數(shù)量偏差不少于5%，否則重新加樣。

  對橫跨刻度上的細(xì)胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則進(jìn)行計數(shù)。

  為降低細(xì)胞計數(shù)誤差，濃度最好控制在5×105個細(xì)胞/ml以上（每個大方格有50個以上細(xì)胞）；

  計數(shù)時，只計數(shù)完整細(xì)胞，如有聚團(tuán)細(xì)胞細(xì)胞則按一個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

  上述是為大家介紹采用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)方法和步驟。希望你可以通過上述步驟對您細(xì)胞計數(shù)有了解，除此之外，細(xì)胞計數(shù)還有自動計數(shù)法，本篇不在累贅。下伙伴們可以業(yè)余時間去嘗試和對比，找到它們之間特點而提高細(xì)胞計數(shù)效率。