實驗實驗常用的elisa試劑盒在科研中常用于測量生物樣本中抗原、抗體、肽、蛋白質、激素或其他生物分子的存在和/或濃度。它非常靈敏，能夠檢測出低濃度的抗原。ELISA的靈敏度歸因于它能夠檢測單個抗原-抗體復合物之間的相互作用。除此之外，加入酶偶聯抗原特異性抗體可以將無色底物轉化為顯色或熒光產物，這些產物可以通過酶標儀檢測和輕松定量。當與已知抗原滴定量產生的值進行比較時，可以確定實驗樣本中相同抗原的濃度。

  雖然不同的科研人員可能使用不同的ELISA試劑盒方案來測量樣本中的抗原濃度，但這些方案都基于相同的原理。選擇要執行的ELISA類型（間接、夾心或競爭）取決于許多因素，包括要測試的樣本的復雜性和可用的抗原特異性抗體。間接ELISA常用于確定免疫反應的結果，例如測量樣本中抗體的濃度。夾心ELISA最適合分析復雜樣本，例如組織培養上清液或組織裂解物，其中分析物或目標抗原是混合樣本的一部分。最后，當只有一種抗體可用于檢測目標抗原時，最常使用競爭性ELISA。競爭性ELISA還可用于檢測只有一個抗體表位的小抗原，由于空間位阻，這種抗原無法容納兩種不同的抗體。接下來上海紀寧生物為大家詳細描述一下ELISA試劑盒檢測方法及實驗步驟。

  間接ELISA法及實驗步驟

  間接ELISA檢測通常用于測量血清或雜交瘤培養上清液中的抗體量。間接ELISA檢測的一般步驟如下：

  用抗原包被孔

  加入含有抗體（一抗或1°抗體）的血清或雜交瘤培養上清液

  孵育并清洗

  添加二抗（或2°）酶聯抗體

  孵育并清洗

  添加底物

  夾心ELISA法及實驗步驟

  夾心ELISA檢測不同于間接ELISA檢測，因為該方法不涉及用純化的抗原包被板。相反，使用“捕獲”抗體包被板的孔。抗原“夾”在捕獲抗體和第二個“檢測”酶偶聯抗體之間——其中兩種抗體對同一抗原具有特異性，但針對不同的表位。通過與捕獲抗體/抗原復合物結合，檢測抗體保留在板中。單克隆抗體或多克隆抗血清可用作捕獲和檢測抗體。夾心ELISA的主要優點是分析前無需純化樣品。此外，該檢測非常靈敏。許多市售ELISA試劑盒都是夾心類型，使用經過測試的匹配抗體對。夾心ELISA檢測的一般程序是：

  用捕獲抗體包被孔

  添加含有抗原的測試樣本

  孵育并清洗

  添加酶聯檢測抗體。

  孵育并清洗

  添加底物

  大多數市售的夾心ELISA試劑盒都配有酶偶聯檢測抗體。如果沒有酶偶聯檢測抗體，可以使用針對檢測抗體的特異性二抗。二抗上的酶起著相同的作用，即將無色底物轉化為顯色或熒光產物。例如，上述二抗更傾向于在由已經生成自己的單克隆抗體的研究人員開發的“自制”夾心ELISA中使用。使用二抗的一個缺點是要確保它只與檢測抗體結合，而不是與結合到板上的捕獲抗體結合。這將導致所有孔中都有可測量的產物，無論是否存在抗原或檢測抗體。

  競爭ELISA法及實驗步驟

  最后，使用競爭性ELISA檢測可溶性抗原。該方法操作簡單，但僅適用于純化抗原量較大時。競爭性ELISA檢測的一般程序為：

  用抗原包被孔

  孵育并清洗

  將測試樣品與酶偶聯的一抗預孵育

  將混合物加入

  孵育并洗去任何未結合的酶偶聯一抗

  添加底物

  本測定中的“競爭”源自于這樣的事實：步驟3中使用的測試樣品中的抗原越多，可與孔中包被的抗原結合的抗體就越少。因此，測定結束時孔中顯色/熒光產物的強度與測試樣品中存在的抗原量成反比。

  任何類型的ELISA中的關鍵組成部分都是已知濃度的滴定標準，它使用戶能夠確定測試樣本中存在的抗原濃度。通常，會指定一系列孔來創建標準曲線，其中將已知量的純化重組蛋白以遞減的量添加到孔中。當這些孔與測試樣本同時處理時，用戶可以從微孔板讀數器獲得一組已知蛋白質濃度的參考吸光度值，以配合測試樣本的吸光度值。然后，用戶可以計算出標準曲線，將測試樣本與該標準曲線進行比較，以確定存在的目標蛋白質量。標準曲線還可以確定用戶稀釋的精確度。

  最后，上述每種ELISA類型的最后一步都需要添加底物。底物轉化為產物的程度與孔中存在的酶量直接相關。辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)是與抗體結合的最常見酶。正如預期的那樣，有許多底物可用于產生顯色或熒光產物的酶。此外，底物的靈敏度范圍很廣，可以提高檢測的整體靈敏度。在選擇要使用的底物類型及其相應的酶結合抗體時，用戶還必須考慮實驗結束時可用于讀取板的儀器類型。

  HRP常用的顯色底物包括2,2'-聯氮雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽(ABTS)和3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)，而AP則使用對硝基苯基磷酸酯(PNPP)。ABTS和TMB分別產生水溶性綠色和藍色反應產物。綠色ABTS產物有兩個主要吸光度峰，分別為410和650nm，而藍色TMB產物在370和652nm處檢測效果最佳。加入酸性終止液后，ABTS和TMB的顏色會變成黃色，最佳讀數為450nm。ABTS顯色速度慢，而TMB顯色速度快。TMB比ABTS更靈敏，如果酶促反應進行時間過長，可能會產生更高的背景信號。PNPP經AP轉化后生成黃色水溶性產物，在405nm處吸收光。