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能裂解青毒素和頭孢菌素類抗生素的β-內酰胺環，使它們滅活的水解酶，稱為β-內酰胺酶。以青霉素為底物的稱為青霉素酶，以頭孢菌素作為底物的稱頭孢菌素酶。根據β-內酰胺酶的基質特異性，可大致分為青霉素酶、頭孢菌毒酶、肟型頭孢菌素酶三類。青霉素酶易于分解青霉素類抗生素，頭孢菌素酶對分解頭孢菌素類抗生素的活性較高，肟型頭胞菌素酶則對青霉素和頭孢菌素類都有分解作用，特別更易予分解肟型頭孢菌素。產生青霉素酶的遺傳因子，主要基點在胞質體DNA上，而產生頭孢菌素酶和肟型頭孢菌素的遺傳因子，則大都在宿主染色體上。青霉素酶從其基特異性或酶的生化性狀上的特點，又可分為5種類型(即青霉素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型)。頭孢菌素酶和肟型頭孢菌素酶屬于菌株特有的酶，上述這些酶的精制品、用兔做免疫試驗均可得到抗體。然而，各種類型的β-內酰胺酶，在各自特有的免疫學方面，卻無相互交叉的現象。
目前，β-內酰胺酶的氨基酸序列、立體結構、功能及三者之間的相互關系已基本明確。β-內酰胺酶與D-丙氨酰-D-丙氨酸轉肽酶的三維結構相似，二者來源于同一酶家族。不同的β-內酰胺酶，其分子一級結構迥異，但三級結構相似。依據Ambler分類法，B類酶即金屬β-內酰胺酶的活性位點幾乎都有金屬離子Zn2+；B類酶之外的其他類酶，統稱絲氨酸β-內酰胺酶，其活性位點都有絲氨酸(Ser70)。
絲氨酸β-內酰胺酶在參與底物識別和催化的過程中，均依賴若干高度保守的序列，以一定空間結構協同發揮作用。Ω環作為特別的聯體，可把親核水解反應所需的水分子準確定位。A類酶中第224位點的精氨酸則可同時定位另一個水分子，此雙水分子同時定位的結構可水解克拉維酸和舒巴坦等；而C類酶無此結構，故不能水解克拉維酸。Ω環高度保守的第166位點的谷氨酸可促進β-內酰胺酶脫酰基。Ω環與其他聯體各自作為一個結構域單元，它們之間的相對位置所形成的空腔，即為β-內酰胺酶與底物作用的結合腔。結合腔中央是酶的活性位點Ser70。Ser70的－OH、－NH－與237位點的丙氨酸殘基的－NH－共同構成“氧離子口袋”，使抗生素β-內酰胺環上的羰基極化，形成酰化酶復合物。β-內酰胺酶的活性部位結構，不論是源于染色體還是質粒，都有一個α螺旋結構域與5條反向平行的β片層結構，因此，結合腔與“氧離子口袋”的位置關系恰是α螺旋結構域的外層與內層的關系，該α螺旋結構域其實更像是“@”形的結構。通過氨基酸的替換使結合腔的結構改變，從而具有較大空間位阻的底物可到達活性位點與Ser70結合，這是細菌對抗生素耐藥及耐藥譜擴大的重要機制。金屬β-內酰胺酶已被證實的部分酶為晶體結構，其結構主要相似之處為：都有與Zn+結合的保守系列HXHXD區，即116～120位點氨基酸；均有一個同樣的αββα的夾心結構，其外側為兩個α螺旋，中心為β片層，β片層一端含有Zn+結合位點。因所含金屬離子數目各不相等，形成了酶與底物結合方式的多樣化。該類酶主要是通過金屬離子與氨基酸形成配位化合物以干預活性位點的反應。而活性位點與Zn+親和力的強弱不一，這是各金屬酶水解能力互異的重要原因。
總體上分為活性位點含絲氨酸殘基的絲氨酸β-內酰胺酶與活性依賴金屬離子(多為Zn2+)的金屬β-內酰胺酶。該分類方法有助于臨床對酶抑制劑的選擇。1995年Bush-Jacoby-Medeiros(B-J-M)分類法形成并被普遍接受。該法根據抑制劑、物及結構的不同，把β-內酰胺酶劃分為4群。與此同時，根據氨基酸與核苷酸序列的不同，各群又分屬于相應的分子類型。
第1群大多為染色體介導，少數由質粒介導，均屬于不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶。第2群由8個亞群組成，可被β-內酰胺酶抑制劑抑制，其中，少數不被克拉維酸抑制。該群酶的種類和數量較多，多為質粒介導。第3群由3個亞群組成，其活性依賴金屬離子(多為Zn2+)的參與，因此又稱金屬β-內酰胺酶。該群酶可使幾乎所有的β-內酰胺類抗生素失活，如2010年引起全球廣泛關注的NewDelhimetallo-β-lactamases-1(NDM-1)就是一個耐藥性超強的金屬β-內酰胺酶，故該群酶臨床上需要特別注意鑒別。隨著NDM-1超級細菌的發現，研究者逐漸將目光更多地投向金屬β-內酰胺酶的研究，該群酶對氨曲南敏感，可被乙二胺四乙酸(EDTA)、菲咯啉及巰基化合物抑制。第4群為青霉素酶，不為克拉維酸所抑制，分子類別待定，并尚不清楚是否被EDTA抑制。
β-內酰胺酶對抗生素的作用主要有水解和非水解兩種方式[4]。大多數β-內酰胺酶的活性位點具有一個縱行溝狀結構，該結構疏松易彎曲，利于底物的結合。抗生素β-內酰胺環上的羰基碳可以不可逆的結合在該活性位點處的絲氨酸上，使抗生素β-內酰胺環解開，造成抗生素降解，避免抗生素的檢出。另外一些抗生素如金屬酶，它們是利用二價金屬離子與組氨酸或半胱氨酸結合，并與抗生素羰基中的酰胺鍵相互作用，抑制抗生素發揮作用，避免抗生素的檢出。目前國際上研究比較活躍的是超廣譜β-內酰胺酶和頭孢菌素酶。
抗生素是對細菌的生存構成的選擇性壓力之一，而細菌耐藥則是對該壓力做出的自然選擇。在該壓力作用下，少數細菌成為“持留菌”并繼續生長繁殖，“持留菌”被認為是當前細菌感染治療無效的主要因素。新近研究逐步揭示了“持留菌”耐藥機制，即“蛋白網絡”理論的提出，有望使臨床耐藥菌感染的治療獲得突破性進展。β-內酰胺酶的產生與自然界微生物生成的β-內酰胺類抗生素的刺激有關，與之相關的抗生素耐藥性繼而產生，因此在發現和使用β-內酰胺類抗生素之前，該產酶菌的耐藥性已經存在。日益廣泛而大量的β-內酰胺類抗生素的使用，甚至濫用，加速了β-內酰胺酶產酶菌耐藥性的形成及復雜化，以致耐藥菌株不斷增多。其機制除了“持留菌”的因素，還與某些β-內酰胺類抗生素誘導產酶菌基因高突變有關；另外，產β-內酰胺酶敏感菌株通過外源性質粒或(和)轉座子的橫向傳遞，接受相關的耐藥基因而耐藥。β-內酰胺酶耐藥基因又可聯合其他類抗生素耐藥基因編碼重組，導致多重耐藥菌株產生，并且其耐藥水平藉此增強。細菌的耐藥水平是多種機制綜合作用的結果，這一認識解釋了單個抗生素在治療細菌感染時往往無效甚至容易引起耐藥的原因，也是抗生素復合制劑研發的理論依據。細菌的耐藥機制從不同的層次和角度看有不同的解釋，與“蛋白網絡”理論相區別的細菌耐藥的經典理論因基于細菌與抗生素相互作用的特異性而被視為“靶標理論”。
“靶標理論”下的細菌耐藥機制主要有5種：①生成體外生物膜，阻止抗生素的滲透。②細胞壁外膜孔蛋白減少、缺失或突變，抗生素無法導入菌體。③細胞壁外排系統主動泵出，進入菌體的抗生素達不到殺菌濃度。④青霉素結合蛋白發生改變，以致抗生素不能干擾細胞壁的合成。該機制是革蘭陽性菌對β-內酰胺類抗生素耐藥的主要原因，提示其與革蘭陽性菌的β-內酰胺酶主要是胞外酶有某種相關性。胞外酶是革蘭陽性菌分泌至菌體外的β-內酰胺酶，其中也有少量黏附在細胞質膜上。革蘭陽性菌中只有葡萄球菌產生β-內酰胺酶。⑤生成滅活或鈍化酶類。這其中除了氯霉素乙酰轉移酶、氨基苷類抗菌藥物鈍化酶及大環內酯類抗菌藥物鈍化酶外，β-內酰胺酶是最具臨床意義的，因為臨床所見的耐藥菌，約80%與β-內酰胺酶的產生有關。產生β-內酰胺酶并通過水解或非水解的方式使β-內酰胺類抗生素滅活則是革蘭陰性菌對β-內酰胺酶類抗生素耐藥的主要機制，與革蘭陰性菌的β-內酰胺酶主要存在于周質間隙成為胞內酶也有某種相關性，其中有少數可通過滲透的方式轉移到細胞外：①非水解方式是指抗生素分子到達周質間隙后，β-內酰胺酶與之合成無活性而極其穩定的共價化合物，使之無法作用于青霉素結合蛋白的靶位而失活。相關報道中，該方式較水解方式要少見。②水解方式對于金屬β-內酰胺酶而言，其活性位點上的金屬離子，通常是Zn2+與相關氨基酸結合導致β-內酰胺環被破壞，進而使抗生素失效。對于絲氨酸β-內酰胺酶而言，這是較多見的方式。其水解過程為：絲氨酸β-內酰胺酶與抗生素結合成非共價鍵Michaelis復合體，接著該酶活性位點上絲氨酸的自由羥基侵襲β-內酰胺環，生成共價酰酯，酰酯水解使β-內酰胺環開環，經重排后酶失活，同時抗生素自身也被滅活。總之，影響β-內酰胺酶致細菌耐藥的因素，就其自身而言，與酶的種類、數量、位置、動力學及生理生化情況等相關；就抗生素而言，與其種類、有效濃度及其與青霉素結合蛋白的親和力等有關；另外，還與細菌所處的外界環境有關，如溫度、酸堿度、誘導劑或培養基等。
[1] 現代藥學名詞手冊
[2] β-內酰胺酶耐藥機制及其中醫藥相關研究進展
[3] 牛奶中β-內酰胺酶來源及其檢測方法研究進展