9004-54-0 / 右旋糖酐40的制備

背景及概述^[1][2]

右旋糖酐40，又叫低分子右旋糖酐，本品可提高血漿參透壓而增加血漿容量。有改善微循環作用，能防止彌漫性血管內凝血，使靜脈回流量和心搏出量增加，具有滲透性利尿作用。

制備^[2]

CN201410003338.2提供一種右旋糖酐酶的制備方法及其在制備低分子量右旋糖酐中的應用。 本發明提供一種從土壤中篩選出的高酶活右旋糖酐酶產生菌-棘孢青霉，該菌株保藏名稱為：棘孢青霉F1008，保藏單位：中國微生物菌種保藏中心。 本發明運用棘孢青霉F1008發酵培養制得高活性的右旋糖酐酶，其制備步驟包括：

1）菌株活化：采用滅菌固體PDA培養基，將F1008菌株接種在試管斜面上，30-32℃下培養48-60h，然后用于菌株種子液制備；

2）菌株種子發酵培養：種子培養基組分為每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，將步驟1）中的菌株接種到所述的種子培養基中，置于恒溫搖床上30-32℃，轉速220r/min下培養48-72小時作為種子液，然后將種子液用于發酵制備右旋糖酐酶；

3）發酵制備右旋糖酐酶：發酵培養基組分為每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，利用滅菌后發酵培養基，將步驟2）中的種子液按5%的比例接入液體發酵培養基中，置于恒溫搖床上30-32℃，轉速220r/min下培養5天得到相應的右旋糖酐酶的發酵液，然后將發酵液用于分離純化；

4）右旋糖酐酶的分離純化：將步驟3）中得到的右旋糖酐酶的發酵液通過過濾、離心分離菌體，然后再進行硫酸銨鹽析以及瓊脂糖凝膠柱分離，得到純的右旋糖酐酶酶液，運用DNS法測定酶活力。

5）右旋糖酐酶優先降解高分子右旋糖酐的特性：將步驟4）中得到的純酶液與兩種不同分子量右旋糖酐（底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw6655Da）構成的雙底物溶液進行混合，在25℃下催化反應，運用HPLC檢測催化過程中兩種底物的分子量變化，結果見圖1，高分子量的底物E優先被降解，分子量不斷降低，而低分子量的底物F在反應初期基本無變化，從而證實本發明公開的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有優先降解高分子右旋糖酐的特性。

本發明公開的棘孢青霉F1008能夠產生高酶活性的右旋糖酐酶，該右旋糖酐酶的特征在于它的最適作用溫度為25～35℃，最適催化pH為5.0～6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且該右旋糖酐酶在多底物溶液中優先選擇與高分子量的底物反應，非常適用于低分子量右旋糖酐的制備。

本發明公開棘孢青霉F1008右旋糖酐酶在制備系列低分子右旋糖酐中的應用，其方法按如下步驟進行：

按1000mL的反應體系計算，首先將60-200g的蔗糖溶解于pH5.00.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，在25℃下同時添加2000-3000U的市售右旋糖酐蔗糖酶與2500-7500U的右旋糖酐酶，恒溫攪拌反應22-26小時；然后將反應體系置于80℃下保溫1小時滅活右旋糖酐蔗糖酶，紗布濾過變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經真空過濾得到清澈透明的濾液，即為系列低分子右旋糖酐溶液；

最后將該溶液進行旋蒸濃縮70℃旋蒸濃縮去除部分水分，濃縮至原體積一半后進行分級醇沉，采用四級劃分：一級乙醇濃度為48，得到的沉淀為殘余蛋白雜質及少量高分子糖酐；二級乙醇濃度為58，得到的沉淀為10000Da的右旋糖酐；三級乙醇濃度為68，得到的沉淀物為6000-8000Da的右旋糖酐；四級乙醇濃度為78，得到的沉淀物為3000-5000Da的右旋糖酐；每級得到的沉淀置于80℃真空干燥箱中干燥4小時，即得到系列低分子右旋糖酐純品。

本發明的優點在于：

棘孢青霉F1008發酵培養成本低，所產的右旋糖酐酶具有高酶活、高的底物特異性、多底物溶液中優先與高分子量的底物反應、能耗低等優點，在與右旋糖酐蔗糖酶組成的雙酶體系中能夠及時優先降解右旋糖酐蔗糖酶合成出的大分子量右旋糖酐，從而累積低分子右旋糖酐的量，非常適用于工業化運用，利用該酶與市售右旋糖酐蔗糖酶聯合催化蔗糖制備系列低分子量右旋糖酐的反應條件溫和、能耗低，工序簡單；通過調節雙酶體系的工藝參數（蔗糖濃度、雙酶用量、反應時間），可以實現對右旋糖酐分子量的調控；通過后期對反應液進行的濃縮處理，醇沉過程的無水乙醇用量大大減少，從而使得生產成本進一步降低；雙酶催化得到的右旋糖酐分子量分布集中、種類多（10000Da，6000-8000Da，3000-5000Da），總收率高；本發明可以實現低分子右旋糖酐生產工藝低成本化、 環保、低碳、產率提高的目標，為酶法生產右旋糖酐的工業化奠定堅實的基礎。

藥代動力學^[2]

平均分子量約為40000。因分子小，在體內停留時間短，易從尿中排出，故擴充血容量的作用較為短暫。

臨床應用^[2]

用于急性失血性休克、心絞痛、心肌梗死，以及腦血栓形成、腦供血不足、血栓閉塞性脈管炎等。

不良反應^[2]

①少數患者發生過敏反應：發熱、寒戰、胸悶、呼吸困難等;②用量超過1 000ml時，少數患者出血時間延長。

注意事項^[2]

①用藥前取0.1 ml作皮內注射，觀察15min;②充血性心力衰竭及其他血容量過多，有出血傾向者忌用;③肝、腎功能不全慎用。

主要參考資料

[1] 實用處方及非處方藥物大全

[2] CN201410003338.2 一種右旋糖酐酶及其在制備低分子右旋糖酐中的應用