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葡聚糖,又稱右旋糖酐,是指以葡萄糖為單糖組成的同型多糖。葡聚糖鏈長短的不同決定了其藥用價值不同,長鏈葡聚糖通常為血容量擴充藥,分子量在幾萬到十幾萬;而短鏈葡聚糖可以與氫氧化鐵進行絡合,制成葡聚糖鐵,即右旋糖酐鐵。
葡聚糖是蔗糖經腸膜狀明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)產生的右旋糖酐蔗糖酶(dextransucraseEC2.4.1.5)催化合成的高分子葡萄糖聚合物,該聚合物含有95%的α?1,6糖苷鍵,同時含有少量其他糖苷鍵的分支結構。因其具有安全、無毒等多種優點,已被廣泛應用于醫藥、食品和工業等多個領域。高分子右旋糖酐可以用作藥物載體,以及常用的凝膠色譜填料。臨床上常用的右旋糖酐有三種規格:右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20,它們主要用作血漿代用品,用于出血性休克、創傷性休克及燒傷性休克等。重均分子量6?8kDa的右旋糖酐常被制成右旋糖酐鐵,用于治療嚴重的貧血癥。重均分子量5kDa的右旋糖酐常被硫酸化,用于治療血栓。低分子異麥芽糖近來被發現,可用作益生元。作為一種來源豐富的多糖,右旋糖酐是食品工業中的優良配料,主要用作保濕劑、穩定劑、增量及和增稠劑。在工業上,右旋糖酐被用作為油井鉆泥的添加劑。
發酵法結合酶法制備分子量可控的藥用葡聚糖,按如下步驟進行:
(1)腸膜狀明串珠菌發酵合成高分子葡聚糖,包含以下A、B兩步:
A:培養基配制
種子培養基(g/L):蔗糖100,蛋白胨2.5,Na2HPO4·12H2O1.8;發酵培養基(g/L):葡聚糖70(1)15.0,蛋白胨5.0,K2HPO4·3H2O1.0,FeSO4·7H2O0.01,KCl0.5,MgSO4·7H2O0.5,用NaOH調pH至7.4;在0.1MPa壓力下,滅菌20min。
B:腸膜狀明串珠菌發酵合成高分子葡聚糖
在無菌環境下,將腸膜狀明串珠菌以5.0%的接種量轉接到分別裝有100mL種子培養基的3個搖瓶中,于25℃,120r/min條件下培養22h。然后以5.0%的接種量轉接到裝有5.0L發酵培養基的發酵罐中,于25℃,120r/min條件下發酵22h。出料時,向發酵液中加入85%的乙醇使發酵液中乙醇的體積濃度為35%~38%,葡聚糖沉淀后,再經85%乙醇捏洗至“老化”。蔗糖轉化率高達95%,該步驟糖酐收率在85%~90%。
(2)高分子葡聚糖的糊化
將上述步驟1)獲得的750.48g濕糖酐用蒸餾水按照濕糖酐與緩沖溶液按照1∶1.8(w/V)配制成高分子葡聚糖溶液,在90度條件下保溫12小時,標定高分子葡聚糖的濃度為11%時添加55.41mL蒸餾水。
(3)葡聚糖酶催化水解高分子葡聚糖
葡聚糖酶的活力測定:將4mL用蒸餾水配制的3.0%葡聚糖70kDa溶液置于35度保溫10min,再加入適當稀釋的葡聚糖酶液1mL保溫1小時后,采用3,5?二硝基水楊酸(DNS)法測定生成的還原糖。以上述條件下酶分鐘產生1μmol還原糖(葡萄糖當量)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。檢測結果所示葡聚糖酶液活力為300U/mL。
向步驟2)經濃度標定后為11%的高分子葡聚糖溶液中加入葡聚糖酶使其終濃度為0.5IU/mL,加入的葡聚糖酶總活力單位為971.5U,置于35℃條件下攪拌反應130~150min,然后采用100度水浴保溫10min或通入水蒸氣5min的方法,是葡聚糖酶變性失活,從而終止酶催化反應。
(4)去除雜質
將上述步驟3)經葡聚糖酶催化水解的反應液置于80℃保溫30min,冷卻后采用中速定性濾紙過濾,然后將上述濾液采用活性炭攪拌吸附10min后,靜置10min,再利用中速定性濾紙去除活性炭等,清澈透明的濾液用于右旋糖酐分離醇沉。
(5)乙醇分級醇沉及真空干燥
采用4級劃分,一級劃分乙醇體的積濃度為38%,在攪拌裝置下,向步驟4)所得濾液中加入緩慢體積濃度95%的乙醇,根據濾液溫度和酒精度值查表的濾液中酒精的體積濃度,當乙醇的體積濃度達到39%時停止醇沉,將醇沉好的溶液置于40度保溫22h后,倒出上清液,再向沉淀中加入適量乙醇,取出一級沉淀大分子雜質;二級劃分乙醇的體積濃度為43%,向一級劃分后的上清液緩慢加入95%的乙醇,具體操作同上,使溶液中乙醇的體積濃度達到42%時,停止醇沉,將醇沉好的溶液置于34度保溫22h后,倒出上清液,再向沉淀中加入適量乙醇獲得葡聚糖70產品;三級劃分乙醇的體積濃度為47%,向二級劃分后的上清液中緩慢加入95%的乙醇,具體操作同上,使溶液中乙醇體積濃度達到48%時停止醇沉,將醇沉好的溶液置于40度保溫12h后,倒出上清液,再向沉淀中加入適量乙醇獲得葡聚糖40產品;四級劃分乙醇濃度為58%,向三級劃分后的上清液中緩慢加入95%的乙醇,使溶液中乙醇體積濃度達到58%時停止醇沉,將醇沉好的溶液置于室溫靜置2h后,倒出上清液,再向沉淀中加入適量乙醇獲得葡聚糖20產品。
將上述的葡聚糖產品分別置于80℃真空干燥箱中干燥4h,去除產品中殘留的乙醇及水分,最后得到三種不同分子量的藥用級葡聚糖,經搞笑液相色譜檢測,三種產品的分子量分別是68574,39821和21053Da,保留時間分別為13.926min,14.327min和15.054min,分子量分布系數分別為1.86、1.40和1.23,酶解劃分收率為85.35%,對應的產率為15.20%、60.49%和9.67%。當反應時間為130~150min,可以定向制備葡聚糖40為主要的產品。
一種生產小分子葡聚糖的方法,具體步驟如下:
(1)將pH=5、濃度為0.01g/L的葡聚糖酶溶液加入截留分子量為10000Da的聚丙烯腈卷式超濾膜系統中,在操作壓力1.0MPa、溫度30℃下進行過濾濃縮處理,使得葡聚糖酶2完全吸附在超濾膜3的表面或膜孔內;得到酶膜反應器;
(2)在步驟(1)所得酶膜反應器中加入pH=5.5、濃度為100g/L、重均分子量為20000Da的葡聚糖原料1的溶液,在操作壓力為0.6MPa,溫度為50℃下進行過濾,收集透過液中的小分子葡聚糖產物4,測得其平均分子量為4500Da,分子量分布寬度指數為1.8。而在同樣條件下,采用分體式酶膜反應器,葡聚糖酶6沒有起到調控膜孔徑的作用,葡聚糖原料5酶解后通過超濾膜7后獲得小分子葡聚糖產物8,其平均分子量為5600Da,分子量分布寬度指數為2.8,與小分子葡聚糖產物4相比,分子量分布寬度指數增加,平均分子量增大。
(3)待膜通量或產率下降50%以上,將超濾系統內的料液頂出,加入0.1%的氫氧化鈉溶液在40℃下清洗1小時,將超濾膜系統沖洗干凈后再加入0.2%的檸檬酸清洗1小時,然后重新進行葡聚糖酶的固定化和酶解分離。與傳統的分批酶解-滅活-超濾膜分離的方法相比,本方法進行葡聚糖酶解和分離獲得的產率提高20%,葡聚糖酶使用量減少60%,產品純度提高30%。
[1][中國發明,中國發明授權]CN201310247228.6制備分子量可控的藥用葡聚糖的方法
[2][中國發明]CN201711285656.2一種生產小分子葡聚糖的方法及其產品和用途