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辣根過氧化酶使試劑中的發光物（luminol）氧化并發光，而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中，將復雜的蛋白混合物經sds-page分離，并轉移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用于免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。當加入免疫印跡化學發光試劑后，luminol發生氧化降解，并發射波長為428nm的光，此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。
用途：非放射性發光系統，用于檢測固定在膜上的蛋白，其敏感性達1-5pg。用x光片可快速地獲得永久的硬拷貝結果。所含獨特的底物足以維持12小時以上的發光，便于反復曝光操作，免疫印跡膜經抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測。
1. 印跡膜制備按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作，適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對于降低背景非常重要，在與HRP交聯物溫育后，膜片更需仔細洗滌，所有步驟均在室溫下完成。
2. 化學發光試劑的配置在使用前等量混合a液和b液，混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
3.蛋白信號顯現
1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。
2). 置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。
3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。
4). 于暗室中壓上x光片。
5).根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果。顯影沖洗。
6). 調節曝光時間，再次曝光顯影。
4、膜的重復使用：
配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫，最后用bsa（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。
操作注意：
1. 試劑每個批號均獨立優化，請不要混用或稀釋試劑以免降低敏感性；
2. 加入一抗后膜不能再干燥；
3. 適當地封閉和洗滌膜片至關重要；
4. 使用前配置化學發光試劑，配置足夠覆蓋膜片即可，棄去使用過的混合試劑；
5. 使用干凈取樣頭取用每種試劑；
6. 第一張片子建議曝光1分鐘，觀察結果后判斷最佳曝光時間可從30秒至2小時不等；
7. 除了放射自顯影片曝光和洗片處理外，所有步驟均不必在暗室中操作；
8. 膜片可經適當方法洗脫原有抗體，再次印跡使用，在此情況下，此試劑更為理想；
9. 因為它不象生色物質需要從膜片上清除底物。
10. nan3能抑制HRP活性，應避免使用nan3。
安全性：無特殊毒性，按普通化學品處理。如果不慎與眼、皮膚和衣物接觸，請立刻用大量清水沖洗。
儲存：2-8℃密封避光保存一年。
ECL在化學領域，是一種化學發光試劑。electrochemiluminescence
化學發光試劑，一般是WesternBlot的最后一步，加入1：1的溶液A和溶液B，覆蓋pvdf膜，可以顯色來觀察實驗結果。
原理：一般使用的發光液A和B分別是魯米諾和過氧化氫，在辣根過氧化物酶（HRP）的催化作用下，魯米諾與過氧化氫反應生成一種過氧化物，過氧化物不穩定隨即分解，形成一種能發光的電子激發中間體，當后者由激發態返回至基態，就會產生熒光。
在發光過程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP沒降解失活，是可以重復加發光液的。但HRP作為一種蛋白酶，在室溫放置時間過長，是會降解的；同時在發光過程中有什么物質（比如顯影液）污染了膜的話,也有可能滅活膜上的HRP。
HRP 標記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼) , 是一類重要的發光試劑。其結構如圖4 所示。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行,在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH·) , 過氧化氫(H2O 2)]存在下,生成激發態中間體, 當其回到基態時發光, 其波長為425nm。
早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體) ,但標記后發光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體, 進行免疫反應后利用魯米諾作為發光底物, 在過氧化物酶和起動發光試劑(NaOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發光, 發光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM半自動分析系統就是利用這一體系專門設計的。
增強發光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA )在發光系統中加入增強發光劑, 如對2碘苯酚等, 以增強發光信號,并在較長時間內保持穩定, 便于重復測量, 從而提高分析靈敏度和準確性。在全自動分析儀上, 還可通過計算機嚴密控制, 進行自動操作, 如加試劑,混合, 溫育, 洗滌, 加發光試劑, 發光計數, 數據處理, 繪制標準曲線, 直至完成病人血清樣品的分析并打印出結果。Am erliteTM發光增強酶免分析系統用熒光素、噻唑等增強劑, 其發光時間可持續長達20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。
ALP標記的CLEIA所用底物為環1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發光底物 ,用于化學發光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩定作用的基團——金剛烷基, 其分子中發光基團為芳香基團和酶作用的基團,在酶及起動發光試劑作用下引起化學發光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 spiroadam an2tane ) 42methoxy242( 3’2 phosphoryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2’2螺金剛烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22環二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(AL P) 作用下,磷酸酯基發生水解而脫去一個磷酸基, 得到一個中等穩定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) ,此中間體經分子內電子轉移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發態的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當其回到基態時產生470nm 的光,可持續幾十分鐘。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學發光底物,可用來檢測堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結合物。可檢測到堿性磷酸酯酶的濃度為10- 15mol/L 。