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己糖激酶(Hexokinase)是生物體呼吸代謝過程中的關鍵酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有細胞中，是細胞產生能量所需要的一種酶，共有 5 種亞型，其中 I 和 II 分布在線粒體外膜，與電壓依賴性陽離子通道蛋白結合;這種部位讓己糖激酶能直接獲得線粒體產生的 ATP，ATP是己糖激酶的底物之一。研究證明，己糖激酶在固有免疫系統中發揮模式識別受體功能，類似免疫系統的守門人角色，具有重要的功能。這種機制不僅在動物細胞存在，在人體細胞內同樣存在。因此，己糖激酶常被用作監測人體健康狀況的指標，目前己糖激酶已應用于血糖檢測試劑盒中，利用己糖激酶法測定血糖含量是國際上推薦的葡萄糖測定方法，但因己糖激酶是小酶種，中國研究領域對其關注度不高，市場上的己糖激酶制劑均為進口產品，故血糖檢測試劑盒價格相對較高?，F提供了一種制備己糖激酶干粉的方法，并對所制得的干粉進行了酶學性質研究，為降低己糖激酶血糖檢測試劑盒的成本提供了理論依據。
菌種的制備[1]：將凍存管的菌種BW25113-pYBE／sc己糖激酶活化后，以1％接種量接種于含有50μg／mL璉霉素的基礎培養基中，于37℃，180 r／min的條件下培養8 h。
基礎發酵工：將上述培養的種子液以2％接種量轉接到100 mL／500mL的基礎培養基中，于37℃、180 r／min的條件下培養至1．5 h后加入1 mL 20％的L-阿拉伯糖誘導，之后在相同條件下培養14 h。
菌體的破壁工藝：將上述培養的發酵液在4℃，10 000 r／min條件下離心10 rain收集菌體細胞，并用50 mmol／L、pH 7．6的TEA-HCL緩沖液溶解于50 mL離心管，在冰浴條件下，選用6 mm變幅桿、200 W的功率進行細胞破碎，破壁期間超聲波工作1．5 S間歇1s，設1，2，3，4，5，6，7，8min 8個破壁總時長，破壁后分別對破壁菌體進行顯微觀察，以破碎菌體數對菌體總數的比值來計算破壁率，并對離心后收集的上清液進行酶活性測定，綜合破壁率和酶活力指標確定最優破壁時長。
己糖激酶的純化工藝：重組己糖激酶采用鎳柱親和層析法進行純化。將獲得的己糖激酶上清液利用pH 8．0含50 mmol／L NaH2PO。、2mmol／L咪唑、0．3 mol／L NaCl的洗滌液對雜蛋白進行洗脫，之后利用pH 8．0含50 mmol／L的NaH2PO4、50 mmol／L咪唑、0．3 mol／L的NaCl的洗脫液對目的蛋白進行洗脫，收集洗脫液后用SDS-PAGE進行分析。
酶活性測定方法：將收集的己糖激酶粗酶液活力進行測定。分別添加1 mL濃度為0．05mol／L的TEA-HCL，1 mL濃度為0．555 mol／L的肛葡萄糖，0．1 mL濃度為0．019 mol／L的ATP，0．2mL濃度為0．1 mol／L的MgCl2，0．2 mL濃度為0．014 mol／L的NADP+，0．02 mL濃度為125U／mL的葡萄糖一6一磷酸脫氫酶到試驗管和空白管，混勻后于25℃水浴1 min，于340 nm處讀取吸光值A1。然后試驗管加入0．05 mL待測酶液，空白管加入0．05 mL的ddH20，于25℃繼續反應5 min，后讀取吸光值A2。酶活力計算公式如下圖：（式中，2．57為反應液總體積，Df為稀釋倍數，6．22為p-NADPH在340nm處的吸光系數，0．05為比色皿體積。）
圖1 酶活力計算公式
凍干工藝：通過對制得的己糖激酶干粉進行研究，初步確定己糖激酶酶學性質。己糖激酶的最適溫度為 50 ℃，熱穩定性試驗表明己糖激酶具有一定的耐熱性。此外，己糖激酶最適 pH 在 8. 0 左右，說明該己糖激酶較適于中性偏堿的條件，在 pH7. 0 ～9. 0 之間比較穩定，處理 20 h后仍有較高的活性，為己糖激酶應用于血糖檢測試劑盒奠定了基礎。
超聲波破壁提取己糖激酶粗酶液常見的微生物菌體破壁提取胞內酶的方法有超聲破碎、酶溶法、高壓勻漿法等。通過對比溶菌酶、溶壁酶、超聲破碎提取菌株BW25113-pYBE／sc己糖激酶發酵生產的己糖激酶發現，酶溶法可以破碎大腸桿菌細胞壁，但最終檢測酶活性指標異常偏低，推測溶菌酶與溶壁酶可能會影響己糖激酶的活性。本研究采取超聲波破壁方法提取胞內酶己糖激酶，超聲破壁對胞內酶的提取影響比較復雜，超聲時間短菌體破壁不充分，胞內酶不能充分釋放；超聲時間過長則會對酶的構象產生影響，進而改變酶的活性。本試驗超聲波破壁結果所示，5～8分鐘的破壁率均能達到100％，菌體破壁充分，但5分鐘以上的破壁總時長會降低酶活性，故最終選擇破壁總時間為5分鐘。
超聲波破壁后得到粗酶液，用鎳柱親和層析法進行純化，其中CL為破壁后的粗酶液條帶，經過純化工藝后獲得單一的蛋白條帶(E3)，分子量大小為60 kD，經測定表現為己糖激酶活性，粗酶液經純化后獲得純度較高的己糖激酶。
己糖激酶法測定人體血糖具有特異性高、抗干擾能力強、準確度高的優點，是臨床檢驗中輔助醫生精確診斷病人血糖水平的最佳方法，也是WHO推薦的測定血糖的參考性方法。但國內沒有自主知識產權的己糖激酶產品，血糖試劑中的己糖激酶依賴進口，導致己糖激酶法血糖試劑盒價格昂貴，限制了己糖激酶法在血糖測定中的推廣應用。
[1] 劉春卯，羅同陽，胡美榮，等． 診斷試劑用己糖激酶的制備工藝研究［J］． 河北農業大學學報，2017，40(1): 66-70