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糖磷酸途徑是植物體中糖代謝的重要途徑,其主要生理功能是產生還原性的供生物合成需要的NADPH,以及可供核酸代謝的磷酸戊糖和氨基酸與脂肪酸合成的一些中間產物;同時在保持植物細胞的氧化還原平衡方面也起到非常重要的作用。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化戊糖磷酸途徑的第一步不可逆氧化反應,是關鍵性調控酶。動物體內G6PDH為X染色體連鎖遺傳,它的缺乏會導致紅細胞代謝紊亂、視網膜血管堵塞、酮病等,嚴重者會危及生命。而它的過表達會引起人體脂質代謝異常,卻能增加果蠅的壽命。在植物中,許多研究者從多種途徑研究其與植物生長發育及各種環境脅迫的關系,以期更清楚地闡述戊糖磷酸途徑及該酶可能的生理功能。
G6PDH是磷酸戊糖途徑的限速酶,控制著這條途徑的碳流和還原力NADPH的產生。G6PDH催化產生的NADPH不僅為細胞內某些生物大分子的生物合成提供了還原力,而且是還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)再生的唯一還原力,因此G6PDH在細胞抵抗氧化脅迫的過程中起著重要的作用。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的分離純化如下:在0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液中,以溶脹法從酵母中提取胞內酶.粗抽提液經過60%~75%飽和度的硫酸銨鹽析,SephadexG-100凝膠柱層析。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的收得率為12.4%,純化倍數達51.2。實驗方法為:
1)粗抽提液的制備:取150g啤酒酵母,加入240mL0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液,40℃攪拌5h,5500r/min離心30min(4℃),上清液即為粗抽提液.
2)酶的純化:用飽和度(質量/體積百分比d)分別為50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%的硫酸銨分段鹽析沉淀粗抽提液,離心收集沉淀物.取60%~75%飽和度的鹽析沉淀,溶于0.05mol/LTris-HCl(pH7.8)緩沖液中,上SephadexG-100凝膠層析柱(3cm×36cm),用相同緩沖液洗脫(層析速度:0.6mL/min)。
3)酶活力的測定:于石英比色皿中加入3mL0.05mol/LTris-HCl緩沖液,30μL0.05mol/LNADP溶液,20μL1mol/LG-6-P溶液后混勻,再加入10μL酶液,快
速混勻后立即在340nm處測定吸光度變化值,計算酶活力.以每分鐘催化1μmol底物轉化為產物的酶量定義為一個酶活力單位(U)。
G6PD廣泛存在于人體各種細胞,是磷酸戊糖通路的限速酶,在此代謝過程中產生還原型煙酰胺膘呤二核苷酸磷酸(NADPH),后者是所有類型細胞內最重要的還原劑。尤其在紅細胞中,磷酸戊糖通路是NADPH的唯一來源,對氧化損傷的防御機制高度依賴于G6PD活性,因此G6PD缺陷患者的紅細胞極易受到氧化應激的損害。
機體的抗氧化系統主要包括過氧化氫酶、超氧化物岐化酶和谷胱甘肽。盡管所有的抗氧化系統對細胞的生存都很重要,但G6PD具有獨特的作用。
首先,谷胱甘肽和硫氧化還原蛋白系統在細胞內具有重要的抗氧化功能。而NADPH是這兩個系統必需的重要底物,將氧化型的谷胱甘肽和硫氧化蛋白轉化為其還原型,從而發揮抗氧化作用。
其次,過氧化氫酶是細胞內另一個重要的抗氧化酶,將過氧化氫轉化為水和氧,這一過程并不需要NADPH,但是過氧化氫酶上有特異性的NADPH結合位點,NADPH具有別構效應,結合后使過氧化氫酶保持在活化狀態。雖然細胞內的NADPH合成還有其他來源,但研究發現G6PD是最主要的途徑,對于抗氧化系統的正常作用以及細胞的生存具有重要意義。因此,G6PD活性的降低以及NADPH的水平降低會直接影響這些抗氧化系統的正常功能,引起細胞和器官的損害。
[1] 高等植物葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的研究進展
[2] 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的分離純化
[3] 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在糖尿病及其并發癥中的作用及機制