72-18-4 / 生物素對L-纈氨酸發酵的影響

L-纈氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，在人體內有特殊的生理功能，是維持人生命活動的重要物質。微生物發酵法逐漸成為世界范圍內生產L-纈氨酸的主要方式，而發酵法生產L-纈氨酸的成本則主要受到發酵水平高低的影響。目前，L-纈氨酸主要利用經代謝工程手段改造之后的谷氨酸棒狀桿菌進行發酵生產，而這種方法目前主要面臨糖酸轉化率不高、主產物積累造成反饋抑制以及副產物丙氨酸中后期積累過多影響最終L-纈氨酸提取的問題。

生物素又稱VH、VB7和輔酶R，以多種方式參與谷氨酸棒狀桿菌的生長代謝。生物素是整個生物界生長發育所必需的元素，在使用谷氨酸棒狀桿菌作為生產菌株發酵生產L-纈氨酸時，生物素添加量直接影響生產菌的生長、增殖和代謝速率，并決定細胞轉型的時間及細胞膜的通透性，添加適量的生物素能夠使產酸高峰期提前，延長產酸周期，從而提高L-纈氨酸的產率，因此，確定一個合適的生物素添加量是提高L-纈氨酸產率的有效手段。

1 生物素添加量對菌體生長及L-纈氨酸產率的影響

經過14 h的種子培養及52 h的發酵培養，隨生物素添加量的增加，菌液OD600nm分別達到了1.621、1.761、1.768和1.830，L-纈氨酸的最終產量分別達到了48、72、64 g/L和58 g/L。可見生物素添加量對L-纈氨酸產量的影響顯著：在發酵培養基中生物素添加量越高，菌體生長越快，最終菌體濃度越高；生物素添加量過高時，菌體生長迅速，發酵前期產酸速率高，中后期產酸速率下降，最終產量降低；生物素添加量為50μg/L左右時，L-纈氨酸產量最高，菌體量生長適中。

2 生物素添加量對菌體耗糖速率及糖酸轉化率的影響

經測算耗糖量，在初糖質量濃度80 g/L的發酵中，隨生物素添加量的增加，初糖質量濃度降至10 g/L水平所需發酵時間減少，依次為22、19、18、16.5 h，可見菌體耗糖速率與生物素添加量呈正相關；結果顯示，根據每4 h所記錄流加糖量，發酵進行至30 h左右時，耗糖進入高峰階段，菌體生長速率趨于平緩，菌體消耗的葡萄糖更多的用于合成代謝產物，此時L-纈氨酸與L-丙氨酸皆處于快速生成階段；發酵結束時，生物素添加量由低到高的批次糖酸轉化率依次為24%、32%、27%和22%?？梢姡刂粕锼靥砑恿靠捎行岣週-纈氨酸的生產效率，降低生產成本，提高發酵生產的效益。

3 生物素添加量對副產物L-丙氨酸的影響

結果顯示，發酵結束時，隨生物素添加量的增加，L-丙氨酸產量分別為9、12、15、22 g/L?？梢奓-丙氨酸產量與生物素添加量呈正相關。

4 在線膜偶聯間歇透析發酵工藝

選取生物素添加量50μg/L的發酵批次作為標準，每間隔4 h取樣離心，測定發酵液中L-丙氨酸含量與L-纈氨酸含量，結果顯示，在發酵前中期，菌體處于生產L-纈氨酸速率較高的階段；發酵后期，L-纈氨酸產酸速率下降，L-丙氨酸產酸速率提升，因發酵液內L-纈氨酸產量過高而產生反饋抑制現象，菌體內代謝流量更多地流向L-丙氨酸方向，使得L-丙氨酸產量增多，降低了L-纈氨酸的轉化效率。

如圖8所示，采用在線膜偶聯透析發酵工藝，在發酵進行至28 h時，罐內L-纈氨酸質量濃度累積至40 g/L，L-丙氨酸質量濃度累積超過了3g/L，主產物受到抑制，副產物進入快速生成階段，此時對發酵液進行在線膜偶聯透析，分離出發酵液內較高質量濃度的L-纈氨酸和L-丙氨酸，截留罐內菌體，使其在新加入的透析培養基中迅速恢復活力并繼續發酵產酸；透析之后，罐內L-纈氨酸質量濃度降至3 g/L左右，L-丙氨酸質量濃度降至0.3 g/L左右，繼續發酵24 h左右，罐內L-纈氨酸質量濃度再次達到40 g/L，且L-丙氨酸也再次累積至3 g/L，此時對發酵液進行第2次透析，降低罐內主副產物的含量，使發酵延續下去，延長菌體產酸周期，并大幅提高單批次發酵總產酸量。

如表2所示，透析前后發酵糖酸轉化率由32%提高到34.5%，主產物產量增加，副產物產量降低，耗糖量也相應增加，罐內發酵液體積更接近初始裝液量，穩定性增強。

討論

本實驗使用的菌株XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）在進行生物素不同梯度實驗對比之后發現，增大生物素添加量后，菌體生物量的確有所增長，但是副產物L-丙氨酸含量增長更為明顯，因此在利用谷氨酸棒桿菌XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）發酵生產L-纈氨酸時，造成L-纈氨酸產量下降的主要原因是丙酮酸節點流量過多地流向丙氨酸途徑，從而減弱了L-纈氨酸途徑，使產酸減少。

因此，如果能夠從代謝改造的途徑對菌種XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）的丙氨酸合成途徑進行干擾或者削弱，丙酮酸節點流向L-纈氨酸的途徑勢必有所增加，從而進一步提高L-纈氨酸產量.采用在線膜偶聯間歇透析發酵工藝能夠直接有效地減少L-丙氨酸的生成，最終發酵液中L-丙氨酸質量濃度保持在3 g/L左右，相較之前的12 g/L降了75%左右，是行之有效的解決方式。

結論

生物素的外源添加對于菌體細胞自身的生長與產酸必不可少，本研究通過對生物素添加量進行梯度控制，確定了谷氨酸棒桿菌發酵生產L-纈氨酸過程中最適的生物素添加量。實驗表明，當生物素添加量為50μg/L時，經過52 h的發酵，L-纈氨酸產量達到72 g/L，糖酸轉化率達到32%；在線膜偶聯間歇透析發酵對于發酵液中主要產物的反饋抑制解除以及副產物的去除具有非常明顯的效果，較透析之前，透析后的L-纈氨酸總產量提高了47.4%，轉化率提高了2.5%，同時副產物L-丙氨酸產量下降了75%。目前，膜偶聯間歇透析發酵還存在一些有待改進的方面，如果能夠對微濾膜進行一些改進，解決上述問題，可進一步提高生產效益。