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甲磺酸酯屬基因毒性雜質(zhì)，限度為 1.5 g/d。1 每天服藥量為 800 mg，據(jù)此，MMS和EMS的限度須不大于1.875 g/g。一些甲磺酸酯的臨床前研究發(fā)現(xiàn)這些甲磺酸酯可直接與生物大分子(DNAs，ＲNAs和蛋白質(zhì))發(fā)生烷基化反應，可能會導致DNA突變，致癌效應和致畸效應近年來，歐洲藥物管理局(EMEA)和美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)陸續(xù)發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)控制的相關法規(guī)，提出了采用毒理學關注閾值，具體含義為:一個1．5g/d的TTC值，即相當于每天攝入1．5g的基因毒性雜質(zhì)，被認為對于大多數(shù)藥品來說是可以接受的風險(一生中致癌的風險小于十萬分之一)，按照這個閥值，可以根據(jù)預期的每日攝入量計算出活性藥物中可接受的雜質(zhì)水平因甲磺酸酯類的雜質(zhì)限度要求較低。
端粒酶(Telomerase)是一種核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,能以自身的RNA為模板,從頭合成染色體末端的端粒DNA,彌補細胞分裂時端粒DNA的丟失,維持端粒的長度并穩(wěn)定染色體。正常人體細胞(非生殖細胞)及釀酒酵母細胞中端粒酶活性的表達很低,用一般的方法幾乎檢測不到,在90%以上的惡性腫瘤細胞中可檢測到端粒酶活性。端粒酶與細胞生長、繁殖、衰老及腫瘤的發(fā)生密切相關。酵母是一種較好的模式生物,通過對其基因組的深入研究將有助于人們了解高等真核生物基因組的結(jié)構(gòu)和功能。近來研究發(fā)現(xiàn),釀酒酵母經(jīng)DNA損傷劑作用后端粒酶活性升高,可能與端粒DNA損傷后修復機制有關。甲磺酸甲酯(MMS)是一種能夠損傷DNA的烷化劑,主要使嘌呤堿基上的氮、氧原子發(fā)生甲基化,導致DNA雙鏈斷裂、點突變。酵母端粒末端序列富含腺嘌呤和鳥嘌呤,是MMS作用的主要靶點。因此,MMS有潛在損傷酵母端粒結(jié)構(gòu)的作用。本研究旨在觀察致癌劑MMS對釀酒酵母S288C細胞DNA損傷反應以及對端粒酶活性的影響,為端粒酶與惡性腫瘤的關系提供科學依據(jù)。一些釀酒酵母DNA損傷反應基因與人類具有同源性,而且這些基因的突變與人類疾病有關。一直以來人們用釀酒酵母細胞研究DNA損傷反應途徑及端粒酶活性關系,作為認識人體內(nèi)DNA損傷與端粒酶活性和癌變的基礎。
本研究將MMS作用于釀酒酵母S288C細胞,觀察到染色體DNA有不同程度的損傷,同時端粒酶活性上調(diào)。端粒酶活性的上調(diào)可能是酵母細胞DNA損傷后修復的需要。已知相關研究結(jié)果揭示,延長端粒或使端粒酶過表達將有利于雙鏈DNA的斷裂后修復。許多研究已發(fā)現(xiàn),在細胞周期S期細胞對MMS是最敏感的,同時有報道認為端粒酶主要是在S期被激活的,釀酒酵母S288C細胞經(jīng)MMS作用后,端粒酶活性上調(diào)可能與該酶的細胞周期依賴性調(diào)節(jié)有關。MMS對釀酒酵母S288C細胞端粒酶活性的上調(diào)作用可能是通過增加S期細胞的百分率而實現(xiàn)的,并可能介導DNA的損傷修復。總之,在釀酒酵母S288C中,染色體穩(wěn)定性所依賴的端粒DNA似乎還是通過端粒酶機制來維持的。因此,端粒酶活性的上調(diào)可能與MMS引起的DNA損傷后修復有關。
1.溶液配制內(nèi)標溶液:稱取甲磺酸異丙酯約12．5mg，置50mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，取該溶液1．0mL，置100mL量瓶中，二氯甲烷稀釋至刻度(2．5ug/mL)，取該溶液10．0mL，置100mL量瓶中，二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液:精密稱取樣品0．2g，加2mL水溶解后，加2mL內(nèi)標溶液提取，分離和轉(zhuǎn)移有機層至約含0．2g無水硫酸鈉的小瓶中，過濾，取續(xù)濾液，即得。對照品溶液:精密稱取甲磺酸甲酯甲磺酸乙酯各約12．5mg，分別置50mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度(250g/mL)，取該溶液1．0mL，分別置100mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度(2．5g/mL)，分別取上述兩溶液1．0mL和濃度為2．5g/mL的內(nèi)標溶液1．0mL，置同一10mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。定位溶液:分別取甲磺酸甲酯甲磺酸乙酯甲磺酸異丙酯濃度均為2．5g/mL的溶液各1mL，分別置10mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，作為定位溶液。
2.色譜條件色譜條件:載氣為高純氦氣;柱流量:1．5mL/min;分流比為2∶1;進樣量1L;采用程序升溫，起始柱溫45℃，保持1min，再以10℃/min，升到135℃，維持2min;進樣口溫度為240℃質(zhì)譜條件:離子源溫度為230℃;接口溫度為260℃;溶劑延遲時間:2．5min;檢測器電壓:調(diào)諧電壓;電子能量:70eV;掃描(檢測)方式:選擇性離子檢測(SIM)甲磺酸甲酯乙酯異丙酯m/z的為80，79和123
MMS和EMS限度較低(1.875?g/g)，因此需要綜合限度、靈敏度及溶解度三者間的關系。曾選用乙腈作溶劑，基線噪音較小，靈敏度高，但樣品在乙腈中的溶解度達不到檢測要求；又分別考察了正己烷和二氯甲烷作為溶劑，兩者基線噪音較乙腈略大，檢測靈敏度略低。樣品在正己烷中雖然溶解度比乙腈高，但仍達不到檢測要求。故最終選用二氯甲烷。
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