635-65-4 / 膽紅素的檢測方法

膽紅素是血紅蛋白及其類似物的代謝產(chǎn)物，在血液中包括以白蛋白為載體的脂溶性游離膽紅素（Bu,多數(shù)）和經(jīng)肝臟極性轉(zhuǎn)化后的水溶性結(jié)合膽紅素（Bc,少量）。臨床實驗室常用的膽紅素檢測方法為重氮法，根據(jù)能否與重氮試劑直接反應，將膽紅素從方法學上分為“直接反應膽紅素”和“間接反應膽紅素”，即：直膽和間膽。其中間膽需要有加速劑（如咖啡因、苯甲酸鈉等）使膽紅素氫鍵破壞后與重氮試劑反應。

那么在此基礎上，問題的關(guān)鍵就在以下兩點：

1、直接膽紅素的問題

直膽理論上是指所有能溶于水的膽紅素，而實際上只包括了參與快反應（60秒）的大部分Bc,卻又因反映環(huán)境中的某些因素（如乙醇、尿素、咖啡因、尿酸等）可破壞氫鍵，少量游離膽紅素也會參與直接反應。這也是為什么健康人的直膽理論為0而實際測得不為0的原因。簡言之：實際測得的直膽=大部分Bc+少許Bu。

2、δ-膽紅素的問題

在高膽紅素血癥時，患者血液中的白蛋白長時間“浸泡”在膽紅素環(huán)境中，發(fā)生酶促反應，白蛋白置換部分葡萄糖醛酸和膽紅素以共價鍵牢固結(jié)合，成為δ-膽紅素（Bδ）。也就是說，Bc=mBc(單糖)+dBc(雙糖)+Bδ。在實質(zhì)性黃疸或阻塞性黃疸急性期Bδ可達20%-50%；而當臨床恢復期總膽紅素開始下降時（Bc半衰期僅幾小時），由于Bδ的半衰期長（與白蛋白相同，約21天），其比例可上升至50%-90%。

由于Bδ可溶于水，當然參加了直接膽紅素反應。在結(jié)合膽紅素得到正確治療發(fā)生快速下降時，而Bδ不易消除，就可能出現(xiàn)“直膽比例越治越高”的假象，與臨床預期“不相符”的檢測結(jié)果。

檢測方法

目前已有其他檢測方法可以避免以上現(xiàn)象，如HPLC和膽紅素的干片法檢測。其中干片法在臨床應用較為廣泛，它的膽紅素結(jié)果不再是濕化學法提供的總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素，而是總膽紅素、結(jié)合膽紅素、游離膽紅素以及δ膽紅素。而且干化學法可以減少黃疸、脂濁對于膽紅素的影響，對于一些高膽紅素標本來講，濕化學法往往會出現(xiàn)檢測值高于實際值的正向干擾情況，而干化學可以很好的規(guī)避黃疸對膽紅素的檢測干擾。

1、膽紅素檢測的常用方法及其優(yōu)缺點

（1）濕化學法：反應均在液體試劑中進行，重氮法、氧化酶法、化學氧化（如釩酸鹽氧化法）法等。

A、重氮法：在強酸（pH1-2）條件下，膽紅素和重氮離子偶聯(lián)，形成有顏色的偶氮化合物，重氮膽紅素顯色的強度與膽紅素濃度呈比例，光電比色測定。優(yōu)點：可直接比色，手續(xù)簡單、易于自動化。缺點：重氮試劑不穩(wěn)定，須由亞硝酸鈉和氨基苯磺酸臨時生成；易受溶血、脂血等因素干擾，膽紅素濃度過高時影響準確度。

B、氧化酶法：膽紅素氧化酶催化樣品中的膽紅素氧化，生成膽綠素引起450nm處吸光值下降。優(yōu)點：靈敏度高，特異性好。缺點：試劑較昂貴，并受酶的穩(wěn)定性、純度等的影響，易受脂血、溶血的影響。

C、化學氧化法：膽紅素的四吡咯結(jié)構(gòu)具有還原性，因此各種低分子的武技氧化劑和在一定條件下具有氧化性的各種鍍金屬元素都可以氧化膽紅素。常見種類有釩酸鹽氧化法、硝酸鹽鈉氧化法、高碘酸氧化法。優(yōu)點：不受溶血、脂血等干擾物質(zhì)的影響，準確度高，特異性好，與酶法相比具有試劑價格低廉，精密度更高的優(yōu)點。

D、釩酸法：在pH=3的條件下，血清膽紅素可經(jīng)釩酸氧化成膽綠素，從而使膽紅素特有的黃色減少，可根據(jù)加入釩酸前后450nm處吸光度的下降與血清膽紅素呈正比。該法也是臨床常用的生化檢測方法之一，簡單、快速、穩(wěn)定，線性范圍寬，能抵抗溶血、血脂干擾。

(2) 干化學法：反應在干試劑片上進行，無液體試劑

將液體檢測樣品直接加到為不同項目特定生產(chǎn)的商業(yè)化的干燥試劑條上，以被測樣品的水分作為溶劑引起特定的化學反應，利用反射光度法或差示電極法測量，是以酶法為基礎的一類分析方法，又有干試劑化學或固相化學之稱。主要具備以下特點：操作簡單、準確度高、速度快、抗干擾作用強、靈敏度高，目前常用于生化急診標本的檢測，還可用于對常規(guī)檢測結(jié)果進行方法學評價等。

(3)其他：

高效液相色譜法（HPLC）、分光光度法、熒光探針法、單克隆抗體法、傳感器法。方法學的差異使得不同檢測方法的可比性差。