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2-苯乙醇（2-PE）是一種具有玫瑰花香味的脂肪醇，因其具有溫和的、淡雅的玫瑰花般的氣味，被認為是食品和化妝品工業中的重要香料成分。此外，它還可被用作合成其他香料或藥物化合物的底物，如苯乙酸、苯乙醛和乙酸苯乙酯等。在自然界中，2-PE主要從玫瑰、茉莉花、番茄和蕎麥等花卉和植物組織的精油中提取。然而，由于這些植物中的2-PE濃度非常低，因此萃取過程非常復雜，并且花卉的收獲也會受到天氣、植物病害和貿易限制等因素的影響。從玫瑰或其他植物的精油中提取天然2-PE的成本非常高，如提取天然2-PE的原料玫瑰精油國際市場的價格就已高達3500~6000美元/kg。所有這些因素都是導致天然2-PE的供應不足和成本過高的主要原因。
目前，全球市場上2-PE的年產量已經超過10 000 t，其主要生產方法是苯-環氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氫法，國際市場上苯-環氧乙烷合成法產品占40%，氧化苯乙烯加氫法產品占60%。苯-環氧乙烷合成法生產的產品所含微量雜質不同，香氣差異較大，大多不能用于香料，國內主要采用氧化苯乙烯加氫法?；瘜W合成過程一般在高溫、高壓、強酸或強堿環境等惡劣條件下操作，會產生許多不良副產物，如乙苯、苯乙烯等，這不僅增加了下游成本，而且嚴重降低了2-PE的級別。對環保工藝日益增長的需求以及消費者對“天然”產品的偏好極大地刺激了香料和香料生物生產工藝的發展。許多具有2-PE生產能力的野生型菌株已經被分離并鑒定，其中大多數是真核生物，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）等。然而，除了葉微桿菌（Microbacterium foliorum）、變形桿菌（Proteus vulgaris）和嗜冷桿菌（Psychrobactersp.）外，很少有原核生物可以合成2-PE。生物轉化過程通常在溫和的條件下進行，產物選擇性高。此外，根據美國食品和藥物管理局以及相關的歐洲法規規定，如果用于生產過程的底物是天然的，則生物生產的2-PE會被認為是“天然的”。目前，利用生物轉化法生產2-PE已取得重大突破。其中，合成生物學著力于構建“非自然存在下的生化系統”，通過利用不同的生物元件，構建全新的菌株代謝網絡，從而高效合成人類需求的代謝產物。通過使用有效的代謝工程策略可以調節不同酶的基因表達水平，以找到最佳平衡，進而改善代謝通量并減少代謝負擔或其他副作用，從而將廉價的葡萄糖或苯丙氨酸轉化為高附加值的2-PE。本文作者全面綜述2-PE合成的各種途徑、調控機制以及提高2-PE產量的策略。同時，討論了農工廢棄物作為2-PE生產原料的利用和原位產物分離（ISPR）技術的應用。
目前，2-PE的生物合成主要有3種途徑（圖1）。其中，艾氏途徑是最重要的途徑，在氮限條件下，L-苯丙氨酸（L-Phe）通過三步酶催化反應轉化為2-PE。第2個途徑是莽草酸途徑，它是以葡萄糖等碳水化合物為底物從頭合成2-PE。然而，這種復雜的反應途徑具有強烈的反饋抑制作用，導致2-PE生產效率低下。最后一種是苯乙胺途徑，它與艾氏途徑類似，在植物中起著更重要的作用。
圖1 2-苯乙醇的生物合成途徑
EMP—糖酵解途徑；HMP—磷酸戊糖途徑；AT—轉氨酶；PDC—苯丙酮酸脫羧酶；ADH—醇脫氫酶；AAAD—芳香族氨基酸脫羧酶；MAO—單胺氧化酶；PAAS—苯乙醛合酶
艾氏途徑廣泛存在于各種微生物中，它負責將支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和含硫氨基酸（蛋氨酸）分解代謝成相應的雜酸或高級醇。該途徑最初是由艾氏（Ehrlich）描述的，因此用其名字進行命名。如圖1所示，在該途徑中，L-Phe首先被轉氨酶（ARO8，ARO9，BAT1/TWT1和BAT2/TWT2）氨基化為苯丙酮酸，然后被苯丙酮酸脫羧酶（YDR380w/ARO10，YDL080C/THI3，PDC1，PDC5和PDC6）脫羧為苯乙醛，最后通過醇脫氫酶（ADH1，ADH2，ADH3，ADH4和ADH5）或甲醛脫氫酶（SFA1）還原為2-PE。
在艾氏途徑中關鍵酶的表達水平會受到相關轉錄因子的調控和氮調控策略的調節。其中，Zn2CyS6家族轉錄激活因子ARO80是2-PE合成中最重要的調控因子之一。研究結果表明，ARO80可以與aro9和aro10的啟動子組成性結合，在芳香族氨基酸的存在下，ARO80可以激活aro9與aro10的表達。在芳香族氨基酸作為唯一氮源的條件下，芳香族氨基酸通過氨基酸通透酶Gap1進入細胞，Aro80接受芳香族氨基酸的誘導信號后與aro9和aro10基因啟動子上的CCG重復序列結合，激活艾氏途徑關鍵酶基因的表達。除ARO80以外，與碳代謝有關的鋅簇蛋白CAT8同樣是艾氏途徑中一個重要的激活因子，它在調節受芳香醇影響的基因（如Adh2）的差異表達中起著重要作用。同時，CAT8的表達還會受到具有兩個Cys2His2鋅指結構的轉錄因子MIG1的調控，CAT8的過表達或MIG1的缺失可以有效增加aro9和aro10的轉錄，從而使更多的苯丙氨酸轉化為苯乙醛。
此外，艾氏途徑中關鍵酶的表達水平也會受到氮源種類的影響。當培養基中存在優選氮源（銨或天冬酰胺）時，氮分解代謝物阻抑（NCR）的全局氮調控會嚴重限制酵母使用非優選氮源（亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和脯氨酸）的能力。從分子生物學的角度來看，目前已經鑒定出4個可以影響NCR敏感基因的轉錄和翻譯水平的GATA因子，其中包括兩個激活因子（Gln3和Gat1/Nil1）以及兩個阻遏因子（Dal80/Uga43和Gzf3/Nil2/Deh1）。當優選氮源存在時，Gln3和Gat1被隔離在細胞質中，無法參與靶基因的轉錄調控。當無優選氮源存在時，Gln3和Gat1就會轉移到細胞核中，從而激活NCR敏感基因的表達［圖2(a)］。另外，Gln3還會受到pr病毒樣URE2蛋白的負調控，攜帶失活URE2的細胞即使在優選氮源存在時也能夠利用非優選氮源。此外，雷帕霉素也可以影響到氮調控，經過雷帕霉素處理可以模擬氮饑餓環境，從而導致Gln3和Gat1的核定位和NCR敏感基因的激活。研究表明，影響艾氏途徑中關鍵酶表達水平的轉錄調控系統和NCR調節呈現復雜的互補調節和部分自身調節，ARO80是ARO80靶啟動子招募GATA因子所必需的，而GATA因子也可通過氨基酸通透性的轉錄調控間接影響ARO80的活性，兩者之間相互協作共同調控艾氏途徑中關鍵酶的表達。此外，芳香醇的合成還會受到細胞密度的正反饋調節。一般來說，由于芳香醇是群體感應分子，可以使酵母在氮饑餓的情況下轉變為絲狀體，因此高密度的細胞每個細胞可以產生更多的芳香醇。轉錄組分析顯示，在高細胞密度時，aro9和aro10的轉錄水平顯著增強。圖2(b)顯示了通過艾氏途徑合成2-PE的總體調控圖，但其調控機制尚不清楚。
圖2 苯乙醇生物合成的代謝網絡調控
（Gap1/Wap1/Agp1/Bap2/Bap3/Tat2—氨基酸通透酶；ARO9/ARO8/Bat1/Twt1/Bat2/TwT2—轉氨酶；ARO10/PDC1/PDC5/PDC6/THI3—苯丙酮酸脫羧酶；Adh1/2/3/4/5—醇脫氫酶；Sfa1—醛脫氫酶）
莽草酸/苯丙酮酸途徑是酵母等微生物中從頭合成2-PE的途徑。該途徑將碳水化合物代謝與芳香族化合物合成聯系起來，其中包括3種芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和其他芳香族次級代謝物。首先葡萄糖經過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑被轉化為磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖，這兩種物質再經過4步酶促反應轉化為莽草酸，接著莽草酸經過代謝轉化為苯丙酮酸。苯丙酮酸隨后如艾氏途徑所述（圖1）通過脫羧和脫氫被轉化為2-PE。米曲霉、馬克思克魯維酵母和釀酒酵母等均表現出具有利用葡萄糖合成2-PE的能力，但是由于其生物合成途徑復雜，代謝支路多且存在多種反饋抑制因子，2-PE的產量很低。在最佳生長條件下，芳香族氨基酸的胞內濃度足以使苯丙氨酸和酪氨酸敏感的同工酶基本上失活。因此，尋找能夠增加L-Phe或苯丙酮酸池的優質菌株是提高利用莽草酸途徑合成2-PE效率的關鍵。
苯乙胺途徑是與艾氏途徑相類似的途徑，該途徑首先是在釀酒酵母和米曲霉中得到研究。在該途徑中，L-Phe首先被脫羧成苯乙胺，然后被氧化脫氨成苯乙酸，最后被還原成2-PE（圖1）。苯乙胺途徑在諸如番茄等植物中起著非常重要的作用。并且，在矮牽牛花和玫瑰花瓣中已經發現了該途徑的替代方法，其中L-Phe可以通過苯乙醛合酶（PAAS）一步轉化為L-苯乙醛。所有這些天然途徑的研究與發現為構建基因工程菌株提供了有效酶的良好來源。
培養基成分和培養條件對2-苯乙醇的合成影響很大。為提高2-苯乙醇生產的經濟性，研究人員對菌種誘變選育、基因編輯、培養基組成優化、發酵條件優化等常規策略進行了廣泛研究，并取得了很大進展。
2-苯乙醇可由許多微生物進行合成。然而，由于其產量仍然太低，現在并不適合于工業化生產。但是對于艾氏途徑和莽草酸途徑的研究為利用基因編輯等技術提高2-PE的產量提供了廣闊的前景。例如：通過過量表達ARO8和ARO10，S. cerevisiaeS288在培養60 h后可以合成2.61 g/L 2-PE，比原始菌株高出36.8%。為了加快L-Phe在釀酒酵母中的轉運速度，Chen等通過過量表達MT2和S. cerevisiaeYS58來源的Gap1基因來提高芳香族氨基酸轉運體的表達水平，2-PE產量分別增加了26.5%和25.3%。此外，ARO80、GLN3、GAT1和CAT8等全局調控因子的引入，使2-PE產量分別顯著增加58%、34.7%、30.6%和62%。最近，在最佳發酵條件下，一個由L-Phe轉運體Gap1、轉氨酶ARO8、苯丙酮酸脫羧酶ARO10、醇脫氫酶ADH2和谷氨酸脫氫酶GDH2組裝而成的人工構建菌株S. cerevisiaeYS58（G1-A8-A10-A2）-GDH在5 L發酵罐中的2-PE合成產量達到6.3 g/L（轉化率為95%），顯示出2-PE產業化的良好前景。
除艾氏途徑外，利用莽草酸途徑從頭合成2-PE同樣具有重要意義。Aoki和Uchida獲得了一株經過化學誘變處理的突變株Z. rouxiiNISL3355，使2-PE產量提高了約38倍。類似地，Kim等獲得了一株馬克思克魯維酵母的抗苯丙氨酸類似物（對氟苯丙氨酸）抗性突變體，該突變體在不添加L-Phe的情況下從20 g/L葡萄糖中可以產生1.3 g/L 2-PE。相比于傳統的誘變選育等方法，通過基因工程改造對于2-PE的合成則更加有效。最近，Daran等在釀酒酵母中過量表達ARO4、ARO7、3ABP、TKL1、ARO10、PYK1D146N、EcaroL、ARO3K222L，并敲除aro3和aro8，最終使得2-PE的產量達到1.59 g/L。類似地，Xu等通過過量表達ylPAR4、ylARO10、ylARO7、ylPHA2、scARO7G141S，并敲除ylPYK，使得Y. lipolyticaYL35以葡萄糖為底物可以合成2.42 g/L 2-PE，為目前利用莽草酸途徑合成2-PE的最高產量。
雖然酵母具有天然的2-PE合成途徑，但發酵過程通常很長（2~4 d），這增加了設備成本和能源消耗，進一步限制了工業化的可擴展性。因此，除了酵母以外，大腸桿菌也取得了重大突破。由于艾氏途徑不完整，野生的大腸桿菌無法合成2-PE，通過引入玫瑰來源的PAAS基因，經過發酵48 h該克隆菌株可以產0.34 g/L 2-PE。Guo等在大腸桿菌MG1655中共表達aro8、KDC和yigB使2-PE的產量增加到0.28 g/L。同樣的，Atsumi等通過在大腸桿菌BW25113中共表達kivD和ADH2也獲得了類似的結果，2-PE產量最終可以達到0.88 g/L。在艾氏途徑中，提高還原力NAD(P)H是合成2-PE的一個重要因素。在全細胞轉化系統中，Hwang等將來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶引入大腸桿菌，通過氧化葡萄糖來促進NAD(P)H的再生，從而使2-PE的產量提高了3倍。在另一項研究中，將來源于枯草芽孢桿菌的谷氨酸脫氫酶在大腸桿菌BW25113（31G）中過表達，以加速還原力的再生，最終工程菌株的2-PE產量提高了250%。為了改善輔因子與還原力不足的問題，Wang等開發了一種輔因子自給自足的系統，將谷氨酸脫氫酶與轉氨酶和乙醇脫氫酶偶聯，可同時再生共底物（2-酮酸）和氧化還原力[NAD(P)H]，最終使生物催化效率提高了3.8倍。和酵母一樣，大腸桿菌同樣擁有莽草酸途徑，通過引入一條從L-Phe到2-PE的路線，可以使其利用葡萄糖從頭合成2-PE。Guo等通過過量表達aroGfbr、pheAfbr、kdc、yjgB和aro8等基因，最終獲得可以利用葡萄糖合成1016 mg/L 2-PE的工程菌株DG02。Koma等在大腸桿菌中進一步引入了T7啟動子來增強Azospirillum brasilense來源的苯丙酮酸脫羧酶基因（ipdC）和Lactobacillus brevis來源的乙醇脫氫酶基因（adhC）的表達，同時敲除內源的苯乙醛脫氫酶基因（feaB）。該工程菌株最終利用葡萄糖合成7.7 mmol/L（0.94 g/L）2-PE。Kang等優化了莽草酸途徑中4種關鍵酶aroFfbr、pheAfbr、kdc和adh1的協同表達，重組大腸桿菌可以利用葡萄糖合成285 mg/L 2-PE。
生物轉化在2-PE生產中顯示出廣闊的前景。然而，和其他醇類物質一樣，高濃度的2-PE對微生物細胞有一定的毒性，當發酵液中的2-PE濃度達到一定程度時，就會抑制微生物的生長，而且2-PE和乙醇聯合作用產生的毒性比它們各自產生的毒性作用累加要高。2-PE的抑菌作用機理很復雜，但通常認為主要是由其物化特性引起，而不是對特定受體的抑制。抑制作用的主要部位可能是原生質膜，影響糖類和氨基酸運輸系統，此外，由于膜的通透性增加，加速了離子和小分子代謝產物跨膜向胞外擴散，擾亂了跨膜質子電勢。因此，該特性導致的生產力受限仍然是一個顯著的瓶頸，這促使研究人員去尋求性能更優的菌株。商業上用于從葡萄糖生產甘油的菌株Candida glycerinogenesWL2002-5表現出4 g/L的高2-PE耐受性。利用該菌株通過分批發酵可以產生5 g/L 2-PE，是目前使用野生型菌株合成2-PE的最高產量。另外，2-PE的生產已經實現了與隨機突變相結合的巨大進展。例如，經過紫外線輻射處理后，S. cerevisiaeCWY13210的突變菌株與原始菌株相比，2-PE耐受性和產量分別提高了50%和9.1%。同樣，通過紫外線照射獲得的S. cerevisiaeBD-25-39突變體可以合成5.4 g/L 2-PE，比原始菌株提高10.2%。值得注意的是，由于2-PE具有親脂性，仍然難以完全消除其所引起的毒性。因此，仍然需要更有效的誘變和篩選方法。此外，引入一些耐受性因子，例如與膜相關的熱休克蛋白HSP12，可以保護脂質體膜的完整性，避免其受到不利環境的影響。
在工業發酵過程中，發酵培養基的成分對于代謝產物的效價和產率至關重要。如上所述，氮源的利用遵循特定的順序。因此，L-Phe總是作為唯一氮源來激活艾氏途徑。但是，少量的有機氮源，如酵母提取物則有利于細胞生長而不抑制艾氏途徑。有趣的是，Barbosa等發現，通過添加少量無機氮源，如磷酸二銨（DAP），可顯著減少乙醇和乙酸的形成，并增加2-PE的產量。這可能是由于氮源的加入促進了NADH的再生，但其機制仍有待進一步闡明。碳源的主要功能是維持菌株生長并提供必要的輔因子，如2-酮酸和NADH。一般情況下，隨著碳源的增加，2-PE的產量也會增加，但這種提高是有限的。此外，不同的碳源可以改變L-Phe的消耗百分比、2-PE和2-苯乙基衍生物的摩爾產率。通過與果糖、蔗糖、麥芽糖和糖蜜進行比較，發現葡萄糖是S. cerevisiaeCWY132合成2-PE的最適碳源。但是為了降低成本，廉價的碳源（如粗甘油和其他工業廢料）則具有更好的價值。此外，維生素和礦物質對生產2-PE也有很大影響。例如，與初始條件相比，K. marxianusCBS 600在發酵條件優化后需要的維生素劑量是初始條件的80倍，這表明在生物轉化條件下優化后的代謝壓力更大。在惡劣條件下，Ca2+和Mg2+都可以通過增加膜穩定性來保護細胞。當MgSO4添加量增加到0.4 g/L時，2-PE產量提高了1.65倍。當KH2PO4增加到6 g/L時，2-PE的產量也出現了類似的增加。
一般來說，香料的合成過程對培養溫度非常敏感。高溫可以增強一些與酒精產生有關的酶的表達，如BAT1/2。然而，超過最佳溫度范圍，醇類的生成量將顯著降低。以釀酒酵母為例，當培養溫度從30 ℃增加到40 ℃時，2-PE產量下降到1/3~1/23。在20~35 ℃的培養溫度下，L-Phe的消耗量在80.5%~90.1%之間變化；當溫度升高到40 ℃時，L-Phe的消耗量顯著降低21.9%。除了溫度之外，pH也會通過影響酶活性從而影響芳香物質的產量和成分。艾氏途徑中的關鍵酶如ARO8和ARO9是堿性上調的，而ARO10則是相反的堿性下調；因此，需要采用折中的pH來平衡整個艾氏途徑。此外，pH也會改變基質的離子狀態，影響吸附劑對2-PE的吸附容量。在以氨基酸為唯一氮源且葡萄糖受限的有氧條件下，氨基酸主要轉化為雜酸。然而，在厭氧條件下，氨基酸幾乎完全轉化為雜醇。雜酸（和雜醇）的分布與培養條件密切相關。基于此，Tian等在發酵培養基中加入了一些抗壞血酸以提高系統的還原水平，抑制副產物的產生。在這一改良系統中生產的2-PE與標準2-PE樣品表現出最接近的香氣相似性。
除培養條件外，發酵方式對2-PE產量也有影響。據文獻記載，2-PE的合成過程與細胞生長密切相關，當葡萄糖濃度超過一定水平時，在有氧條件下會產生大量乙醇。乙醇的積累對2-PE的產生有很大的協同抑制作用。為了防止發酵過程中產生比1 g/L高的乙醇，Rong等利用活性干酵母生產2-PE。在該體系中，酵母降解乙醇以提供還原力NADH，最終可以利用8 g/L的L-Phe合成7.6 g/L的2-PE。
鑒于培養基組成和培養條件對2-PE生產的影響，需要進行更合理的優化研究。近年來，統計實驗設計如單因素優化、遺傳算法、Box-Behnken中心組合設計、響應面法等已被廣泛使用（表1）。Etschmann等利用遺傳算法優化了13種培養基成分和培養溫度，最終，利用K. marxianusCBS 600將2-PE的產量提高了87%。Mei等采用單因素、正交設計、Box-Behnken中心組合設計和響應面法對培養基成分進行優化，利用S. cerevisiaeBD將2-PE的產量由1.19 g/L提高到4.18 g/L。統計方法的采用不僅減少了工作量，而且評估了多個參數之間的相互作用，特別是在利用復雜的農產工業廢物方面。例如，當Plackett-Burman設計、steepest ascent設計和Box-Behnken設計結合起來優化可發酵培養物的培養基成分、酸堿度和發酵時間時，2-PE產量提高了3.3倍。
表1 基于統計設計的2-PE發酵工藝優化
農業和工業廢物被認為是復雜碳水化合物、蛋白質、脂類和各種營養物質的儲存庫。將這些廢物生物轉化為增值產品，如2-PE，不僅可以防止廢物處置造成的環境污染，還可以增加經濟價值。例如，葡萄含有復雜的成分，包括糖、有機酸、酚類化合物、蛋白質、維生素等，當使用它作為碳源并供應5 g/L L-Phe時，利用K. marxianusCBS 6556可以合成0.77 g/L 2-PE。糖蜜是一種眾所周知的工業廢料，富含混合糖和微量元素。當使用甜菜糖蜜作為碳源并添加7 g/L L-Phe時，利用K. marxianusCBS 600 可以合成0.89 g/L 2-PE。在使用K. marxianusATCC 10022進行固態發酵時，以L-Phe及干燥的固體甘蔗渣為原料可合成2-PE 10.2 mg/g 。當在甘蔗糖蜜廢水中添加6 g/L L-Phe時，使用微生物混合培養物可獲得0.99 g/L 2-PE。另外，季也蒙畢赤酵母、發酵單胞菌和釀酒酵母等都可以利用乳清培養基通過分批發酵的方式合成1.17~3.28 g/L 2-PE。煙草廢料是一種眾所周知的可再生資源，因為它含有豐富的芳香族化合物，是合成香料的潛在前體。在不添加任何L-Phe的情況下使用釀酒酵母可以從39.28 g/L煙草廢料和10 g/L葡萄糖中產生1.55 g/L 2-PE。此外，木薯廢水、番茄、辣椒渣等也都含有豐富的碳水化合物和營養物質，為2-PE的生產提供了可替代的底物。然而，應該指出的是，由于這些農用工業廢物中成分復雜且未知，2-PE的產量仍然很低且不穩定。
香料生產的瓶頸之一是由于其疏水特性會使得脂質膜結構成為優先結合的目標，導致跨膜梯度的崩潰，從而喪失細胞活力。不同的微生物對于香料的細胞毒性表現出不同的耐受水平。例如，2.0 g/L外源2-PE可以完全抑制馬克思克魯維酵母的生長；而釀酒酵母則可以耐受高達4 g/L的2-PE。為了減輕細胞毒性增加2-PE的產量，有機溶劑萃取、疏水吸附、有機滲透汽化、環糊精（CDs）絡合和超臨界CO2萃取等ISPR技術已被廣泛用于去除發酵液中的2-PE。表2列舉了已發表文獻中關于原位產物分離（ISPR）技術在2-PE生產中的應用。
表2 用于2-PE生產的不同的原位產物分離（ISPR）技術
液-液萃取法（LLE）采用有機溶劑從有機相中連續提取疏水產物，因其簡單、廉價、易擴展等特點而被廣泛應用于香精生產。例如，當使用油酸作為萃取劑時，使用釀酒酵母可以獲得12.6 g/L 2-PE，與沒有使用提取技術相比，2-PE的含量增加了8.6 g/L。用油醇作為萃取劑，使K. marxianusCBS 600的2-PE產量提高了3倍。此外，聚丙二醇1500和1200 （PPG 1500和PPG 1200）等高分子萃取劑在2-PE分離中同樣表現出良好的萃取性能。在以PPG 1500為萃取劑的補料分批發酵中，萃取劑中的2-PE濃度超過22 g/L，總濃度達到7.5 g/L。當以PPG 1200為萃取劑時，有機相中2-PE含量為26.5 g/L，2-PE Ac含量為6.1 g/L，2-PE總質量濃度達到10.5 g/L。
在液-液萃取中，發酵液被泵入抽提裝置以連續回收2-PE[圖3(a)]。2-PE生產可以得到顯著改善，但仍存在一些缺陷。首先，有機溶劑會對細胞活力和代謝活性造成嚴重的毒性。因此，理想的萃取劑應具有良好的生物相容性和較高的分配系數。其次，乳狀液的形成將影響液體和溶劑相的分離。最后，也是最重要的一點，液-液分離系統中使用的有機溶劑，特別是高碳含量的有機溶劑，很難蒸發從而去除2-PE，殘留的溶劑會嚴重影響2-PE的質量。因此，尋找合適的有機溶劑是液-液分離操作的關鍵。考慮到2-PE的脂溶性，使用一些脂肪酸/油脂作為萃取劑可作為一種2-PE回收的方法。菜籽油首先被證實可以將2-PE的整體濃度提高2.7倍。此外，疏水中空纖維膜可以被用來阻擋催化介質中的有機溶劑，從而避免乳狀液的形成。但需要注意的是，該膜易受污染。
近年來，不相容離子液體（ILS）因其可忽略的蒸氣壓、不可燃性和高熱穩定性而成為綠色非有機溶劑受到越來越多的關注。通過對9種離子液體的生物相容性、分配系數（Kd）和萃取效率的綜合考察，發現3種基于[NTf2]?的離子液體具有很大的提高2-PE產量的潛力。使用基于[NTf2]?的ILS，觀察到2-PE的總產量增加了3.5倍。此外，[NTf2]?、[TCM]?和[TCB]?基離子液體可以有效地從水相中回收2-PE。
圖3 應用于2-PE生產中的ISPR技術
為了進一步提高萃取效率，研究了一種液-固萃取系統（LSE）。在這個系統中，有機溶劑被包裹到聚合物基質中，這不僅解決了微生物毒性和乳狀液的問題，而且還簡化了下游的加工過程[圖3(b)]。將癸二酸二丁酯包埋在聚乙烯的聚合物基質中后，不僅沒有形成乳狀液，2-PE的產率還提高了1倍。通過將癸二酸二丁酯嵌入到海藻酸鹽微膠囊中，設計了一條將LSE體系與膜工藝相結合的新工藝。在該體系中，不會形成乳狀液，使用S. cerevisiaeGIV2009，最終2-PE濃度提高到5.6 g/L，比使用單相時提高了1.8 g/L。雖然LSE的性能優于LLE，但溶劑固定化會增加成本，使生產過程復雜化。
原位產物吸附（ISPA）是一種常見的ISPR技術，它使用樹脂或其他吸附介質來避免底物或產物的抑制[圖3(c)]。ISPA因其操作相對簡單、易放大、對有毒物質不敏感、易于再生和成本低而被廣泛應用于生物技術過程。為了回收2-PE，人們研究了各種樹脂。非極性大孔樹脂D101對2-PE的吸附能力較強，對L-Phe的吸附能力較低。在添加2 g/L水合樹脂D101的條件下，S. cerevisiaeBD可獲得6.17 g/L 2-PE產量。當使用7%（干重）的交聯聚苯乙烯樹脂HZ818時，用S. cerevisiaeP-3從12 g/L L-Phe中得到6.6 g/L 2-PE，摩爾產率為0.744，比對照提高了66.2%。當大孔樹脂FD 0816作為連續生物轉化系統的吸附劑時，摩爾產率最高，為0.90。然而，樹脂對2-PE的吸附容量很低，而且吸附過程受發酵液的影響很大。該文對幾種聚合物吸附劑進行了測試，以確定具有較高選擇性的吸附劑。例如：將Hytrel?8206應用于固-液兩相分離生物反應器系統，在3 L的發酵體積內可獲得13.7 g/L 2-PE。當采用半連續反應器結構時，2-PE的最高濃度為20.4 g/L，水相為1.4 g/L，聚合物相為97 g/L。
5.4.1 有機滲透汽化
滲透汽化是一種膜分離過程，在膜分離過程中，一層致密的無孔膜將液體溶液從氣相中分離出來。在裝有聚辛基甲基硅氧烷（POMS）膜的有機滲透汽化裝置中，分批培養獲得了2.2 g/L和1.3 g/L的雙倍2-PE濃度。然而，這些膜很容易被污染，仍然需要探索更合適的膜材料。
5.4.2 與環糊精（CDs）絡合
CDs是具有疏水內部和親水外部的超分子主體化合物。眾所周知，CDs及其衍生物與許多有機化合物形成包合物。在最佳條件下，β-CD對2-PE的萃取率為1 mol/mol。
5.4.3 超臨界CO2萃取
超臨界流體（SCFs）具有高吸附能力、高擴散系數和低黏度等特點，被廣泛應用于從土壤、水和沉淀物中提取有機污染物。無毒和不可燃的二氧化碳（CO2）是目前工業中使用的最流行和最便宜的超臨界流體材料。特別是超臨界CO2在玫瑰混凝土揮發油的提取過程中表現出優異的性能。然而，直接利用超臨界CO2萃取是不可能的，因為CO2對細胞活力有很大的影響。因此，在提取之前進行細胞分離是必要的。
由于植物提取的局限性和化學合成工藝的缺陷，生物合成2-PE受到越來越多的關注。雖然在機理認識和提高2-PE效價方面取得了很大突破，但在經濟上仍不具備工業化的可行性。為了將實驗室研究成果轉化為工業過程，底盤菌種開發、生物過程優化和ISPR技術設計之間的深度集成綜合開發是必要的。
在自然界中，許多真菌可以自主合成2-PE，但產量仍然很低。代謝工程對于改善2-PE的生產至關重要，它可以減輕反饋抑制，增強前體轉運，提高關鍵酶活性，并干擾副產物的形成。通過對2-PE合成途徑的改造或引入耐受因子，選擇耐受性好、產2-PE能力強的菌株可能是獲得較好的2-PE生產候選菌株的唯一途徑。此外，目前對2-PE合成的調控機制還沒有進行深入的研究。更好地理解艾氏途徑/莽草酸途徑涉及的生物化學，特別是酶及其代謝調節，是指導進一步遺傳修飾的基礎。
培養基組成和培養條件對2-PE的生產有很大影響。從經濟的角度來看，高增值產品的生產率和產品質量遠比實際產量重要。然而，培養基成分的改變無疑會增加生物催化法合成2-PE的生產成本，不利于該技術的工業化應用。因此，進一步研究利用農業或工業副產品為主要原料，如制糖工業的副產品糖蜜，可以節約生產成本，有利于該工藝的工業化應用。目前報道的不利用原位產物分離技術的2-PE最高生產率只有0.12 g/(L·h)，為了更好地實現2-PE商業化生產，更多的研究應該集中在2-PE的生產率上。
ISPR技術已廣泛應用于2-PE生產中，尤其是LLE和ISPA。然而，LLE系統中殘留有機溶劑的去除困難限制了其應用。與LLE相比，ISPA具有更大的工業放大潛力。在實際生產中，ISPR技術必定會增加生產過程的復雜性和成本，因此，仍需進一步研究開發更多的高容量吸附材料運用于完整細胞的原位產物分離技術，如合成聚合物。隨著生物技術和跨學科的快速發展，采用更先進的發酵方式，如將不同的生物材料應用到微生物發酵過程中，設計使用可以同時合成并分離2-PE的新型反應器等，同時結合ISPR技術，使用優質菌株，將進一步提高2-PE的生產效率。此外，對“天然”香料日益增長的需求將使得利用生物法合成2-PE的商業前景更加廣闊。