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α-葡萄糖苷酶，又稱葡萄糖基轉移酶（α-glucosidase,EC.3.2.1.20），系統命名為 α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它在糖的催化反應中具有水解和轉糖苷的雙重作用。水解作用可從α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非還原性末端切開α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖；轉糖苷作用又可將游離出的葡萄糖殘基以α-1,6糖苷鍵轉移到另一個葡萄糖或麥芽糖類底物上，從而得到非發酵性的低聚異麥芽糖（簡稱IMO）。
自20世紀80年代日本從黑曲霉中篩選出α-葡萄糖苷酶生產菌種，并得以工業化生產酶制劑以來，α-葡萄糖苷酶在基礎研究和工業生產上發揮著越來越重要的作用。目前，國外生產的α-葡萄糖苷酶大部分為純酶，酶活較高；而國內主要以粗酶液為主，酶活較低。而且，國內尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制劑出售，用于生產的酶均來自國外少數幾個酶制劑廠，進口價格昂貴，導致IMO的生產成本居高不，一定程度上制約了我國IMO產業的發展。
選育α-葡萄糖苷酶的高產菌種并建立相應的高效制備工藝是實現α-葡萄糖苷酶低成本商 業化制造的關鍵所在。CN201710281060.9提供一種α-葡萄糖苷酶的高效制備方法。
以微生物或植物來源的α-葡萄糖苷酶基因堿基序列為依據，參考目標宿主菌的密碼子偏好性進行密碼子優化， 并通過采用長引物和低溫易錯PCR的篩選獲得催化性能顯著提升的α-葡萄糖苷酶編碼基因，然后再通過引入強啟動子和高分泌效率信號肽等元件，借助重構的表達質粒增加α-葡萄糖苷酶基因拷貝數，獲得了高效分泌表達α-葡萄糖苷酶的重組菌，結合酶活力差異性篩選獲得活力最高的菌株。結合該菌株的生長特征和產酶特征建立30m3發酵體系下的α-葡萄 糖苷酶高效分泌表達工藝。
實施例:α-葡萄糖苷酶編碼基因在畢赤酵母中的克隆和表達
以黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株（江南大學中國高校工業微生物資源 與信息中心https://cicim-cu.jiangnan.edu.cn）為出發菌株進行培養，收集菌體。采用 TRNzol總RNA提取試劑提取它們的總RNA。以總RNA為模板，參照RT-PCR試劑盒說明書，以 oligo (dT)為引物逆轉錄合成第一鏈cDNA。分別以染色體DNA或第一鏈cDNA為模板，使用引物（SEQ ID NO. 2～SEQ ID NO.13；相鄰的兩個為一對上下游引物）進行PCR擴增出α-葡萄糖苷酶的編碼基因agA、agB、agC、agD、agE和agF。
PCR反應條件如下：94℃預變性5 min；94℃30 s，61℃30 s，72℃2 min，30個循環；72℃延伸10 min。將PCR產物與質粒pPIC9K分別用SnaB I和EcoRI進行酶切、純化，再進行連接，轉化Escheriachia coli JM109感受態細胞。用含有氨芐青霉素的LB固體培養基篩選陽性轉化子，并提取其質粒，用限制性內切酶酶切進行驗證。畢赤酵母的遺傳轉化及篩選：分別將構建成功的6個重組質粒pPIC9K-agA、pPIC9K-agB、pPIC9K-agC、pPIC9K-agD、pPIC9K-agE和pPIC9K-agF（圖4）用Sac I或Sal I進 行單酶切線性化。
酶切產物經純化回收后電轉化轉化Pichia pastoris GS115，均勻涂布于 MD平板，30℃恒溫培養至單菌落形成。挑取多個單克隆重組酵母分別接種于終濃度為0.5、2 mg/mL G418的YPD平板上進行篩選，30℃培養箱培養至長出單菌落，挑取生長情況好的重 組酵母菌株保存，并分別對這6株重組菌進行命名AGa、AGb、AGc、AGd、AGe和AGf。采用畢赤酵母操作手冊給定的培養方法和甲醇誘導發酵方法制備相應的α-葡萄糖苷酶酶液。
（1）將篩選的重組酵母菌株與對照菌株畢赤酵母GS115進行劃線活化，挑取單菌落 分別接種到50 mL YPD液體培養基中（含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素），30℃、180 r/min 培養16～18 h；
（2）按1%接種量分別接入50 mL BMGY 液體培養基中（含有終濃度為50 μg/mL卡那霉 素），30℃，180 r/min培養至OD600=2～6 (約16～18小時)；
（3）收集菌液于滅菌的50 mL離心管中，8000 r/min，離心5 min，倒掉上清，用1/5-1/10 原培養基體積的BMMY重懸細胞，使菌體的OD600=1進行培養，加入甲醇至終濃度為0.5%進行誘導，放入30℃搖床繼續培養；
（4）發酵96小時取樣測酶活（按照前述方法進行測定），并加入甲醇至終濃度為0.5%進行誘導。測定酶活列于表1。表1重組畢赤酵母中α-葡萄糖苷酶的合成水平
[1]CN201710281060.9 一種α-葡萄糖苷酶的高效制備方法