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白色針狀結晶或粉末,無氣味,昧稍甜而微辛。系核苷類的一種,能溶于水,微溶于稀醇,不溶于無水乙醇。
尿苷是構成動物細胞核酸的有關成分,能提高機體抗體水平。動物試驗表明尿苷和肌苷等合用能促進心肌細胞代謝,加速蛋白質、核酸生物合成和能量產生,可促進和改善腦細胞代謝。可用于巨型紅血球貧血,也可與其他核苷、堿基合用于治療肝、腦血管及心血管等疾病。
發酵法生產尿苷(Uridine,UR)的報道,大約與發酵法生產胞苷的報道近乎在同一時期。20世紀80年代后期至90年代中期日本武田化學工業公司的科學家開始發表這一成果,他們共同研究嘧啶核苷發酵,每個人側重于不同的一個課題。尿苷足重要的合成藥物的中間體,抗腫瘤藥物5。氟尿嘧啶,5,氟尿嘧啶核苷,抗病毒藥物5一碘脫氧尿苷歷來都是以化學全合成制取。如以尿苷為前體經半合成或功能基團置換將大大降低此類藥物的生產成本。
以前有些報道使用大腸桿菌、沙門桿菌、產氨短桿菌的變異株產生尿苷酸或尿苷,但產率都不超過59/L的水平,在工業生產上尚不具備價值。也許是同一批人研究了尿苷和胞苷的變育種,他們使用了同一株枯草芽孢桿菌野生菌為母株(No.122),獲得了發酵法生產尿苷和胞苷的成功。
1.尿苷產生菌母株的選育
為了獲得尿苷發酵產率高的菌株,一定要選擇一株嘧啶核苷酸代謝能力較強的菌株,或者稱核酸庫較大的菌株,按照嘧啶核苷酸生物合成代謝圖判斷,乳清酸和乳清酸核苷酸是尿苷酸生物合成的中間體。如果選育尿嘧啶缺陷型(U一)變異株則可以在發酵過程中積累乳清酸和乳清酸核苷,能大量積累這兩種產物的變異株一定有希望積累大量的尿苷,因為此類菌嘧啶代謝途徑相關的酶活性很高,也最合適作為尿苷產生菌的母株。
表8一19顯示了野生型芽孢桿菌的尿嘧啶缺陷型變異株產生乳清酸和乳清酸核苷的情況,其中最優秀的菌株為枯草芽孢桿菌No.122(野生型)誘變獲得的F一100(U一)產生的乳清酸和乳清酸核苷最高。
2.尿嘧啶缺陷型(U)的性狀
圖8—14顯示尿嘧啶缺陷型菌株AF一100在發酵培養基中添加生長因子尿嘧啶最合適的量是50mg/L,增加量使乳清酸和乳清酸核苷二者的積累量顯著下降,這說明尿苷類化合物的生物合成受產物的反饋調控,要選育高產尿苷的菌,必須解除反饋抑制。
3.2一巰基尿嘧啶(2TU)抗性變異株產尿苷
選擇3種尿嘧啶結構類似物——2一巰基尿嘧啶、6一雜氮尿嘧啶和5一氟尿嘧啶對枯草芽孢桿菌No.122(野生型)進行生長抑制反應檢測,觀察到在基本培養基中添加10~10099/ml的每一種藥物即引起生長抑制,而在培養基中含100t_tg/ml尿嘧啶時,對2。巰基尿嘧啶和6一雜氮尿嘧啶解除抑制,因此確定此兩種結構類似物是合適的分離抗性變異株的制劑。將No.122菌株經誘變后選育抗300/Lg/ml 2一巰基尿嘧啶的突變株,在這些突變株中選育到一株37℃80h發酵產尿苷109/L的抗藥性菌株No.258。
4.6一雜氮尿嘧啶抗性變異株提高尿苷產率
上述獲得的No.258是一株抗2TU變異株,但該菌株不能在含有lmg/ml的6一雜氮尿嘧啶的基本培養基平板上生長,它對該類似物的生長反應極敏感,因此用此菌株為出發菌,用亞硝基胍(N—methyl.N7一nitro-N—Ni哪dine)為誘變劑,選育抗不同濃度6一雜氮尿嘧啶的變異株,其中No.508變異株能夠抗5mg/ml的6一雜氮尿嘧啶,發酵產尿苷469/L。
5.降低尿苷磷酸化酶(Upase)變異株提高尿苷產率
No.508菌株與母株No.258比較,顯著提高了尿苷產率,但是副產物尿嘧啶的產率相差無幾,僅從79/L下降至69/L。由于副產物的生成不僅使尿苷對糖轉化率低,而且在工業生產上提取分離工藝復雜化。No.508除積累尿苷之外尚產生較多尿嘧啶是由于該菌株具有分解尿苷成為尿嘧啶的尿苷磷酸化酶(Upase),為此,從No.508再經過二次誘變和一次轉化得到一株缺乏Upase的變異株。
第一步經誘變選育乳清酸核苷酸脫羧酶缺乏的變異株(OMP—Dcase一),它需要尿嘧啶或尿苷維持生長。第二步再誘變Upase缺乏變異株,它在提供尿苷時生長很差,但在尿嘧啶提供時生長很好。第三步經轉化方法回復乳清酸核苷酸脫羧酶活性。最終獲得的No.556菌,尿苷磷酸化酶活力很低,發酵產生559/L的尿苷而產生很少量尿嘧啶,產物對糖轉化率34%。
枯草芽孢桿菌全合成尿苷的途徑見圖8—9。在此途徑中的終產物尿苷酸(UMP)和尿三磷(UTP)抑制合成過程中的6個酶,尿嘧啶衍生物阻遏這6個酶經過誘變選育抗藥性變異株后,尿苷酸調控的6個酶全部被解除了反饋抑制,而且這些酶在變異株中的活性與母株相比提高了16~30倍,而尿苷磷酸化酶只有母株的3/100,因而變異株在一個合適的發酵條件時能大量積累尿苷。變異菌株的遺傳圖譜及產率見表8—23。
1.氮源的作用
尿苷是含氮化合物,無論有機氮和無機氮對菌種的生長和核苷的產率有很大影響,現使用變異株No.556,37℃,80h發酵周期,基本培養基(g/d1)為:葡萄糖16;尿素2;CaC030.5;再添加各種有機氮。
最高尿苷產率的有機氮源為C.S.L 4%加C.G.M 0.7%或C.s.L 4%加酪源0.2%。在發酵全過程中,如采用自動流加液氨控制pH7,但尿苷產率并不能達到最高,經分析,必須有一個合適的銨離子濃度使尿苷產率達到最高。
2.碳源的作用
不同碳源的發酵試驗和葡萄糖為碳源的濃度試驗見表8—26,表8—27。由表8—26,表8—27看出碳源中葡萄糖對產尿苷最佳,初糖濃度18%,尿苷產率和對糖轉化率最高。
3.鈣化合物對產尿苷的影響
在金屬鹽試驗中,鈣鹽如CaC03,CaCl2·2H20極大地促進尿苷的產率(表8—28),最適濃度分別是0.5%和0.3%,但同時發現當鈣鹽被分開消毒時,尿苷產率很低。而鈣鹽與培養基混合消毒,在培養基中沒有磷鹽時,尿苷也顯著減產。因此認為鈣鹽與部分磷鹽絡合,使培養基中存在低濃度的磷離子水平,促進尿苷高產;高濃度的磷鹽不僅菌體生長慢且產量降低。
4.pH的影響
發酵期間控制pH6.0~8.0,對尿苷的產率是穩定的,并顯現開始12h pH下降到6.0左右,至24h增加到7.0,以后保持不變最佳狀態(表8—30)。
5.培養溫度的影響
研究了32~42*(2范圍內溫度不同對尿苷產率的影響,尿苷高產的最適發酵溫度是3812,如表8—31。
6.供氧的影響
使用No.556菌株,200L發酵罐進行了不同供養對產生尿苷的影響,培養基中的溶氧值很強烈地影響尿苷的產率,在OTR為20×10_7mol/(n[1l·min)時,尿苷產率最高;當OTR低于15×10。7mol/(ml·min)時,細胞生長在溶氧濃度減少到0狀態時,尿苷產率顯著降低。
以抗藥性誘變育種為主要目的的枯草芽孢桿菌No.556能夠在一個合適培養基中產生大量尿苷。圖8—15的過程是在6000L發酵罐裝液量為4000L,38℃,攪拌180r/min,通氣量為1500L/min時的結果。12h前從培養基中大量釋放出銨離子沒有尿苷產生,此后隨著糖、尿的消耗,幾乎是平行地產生尿苷直至75h,最高尿苷達659/L。
[1]衷平海,張國文主編,生物化學品生產技術,江西科學技術出版社,2007.5,第205頁
[2]焦瑞身主編,微生物工程,化學工業出版社,2003年07月第1版,第179頁