5746-86-1/降煙堿的危害有哪些

背景及概述^[1]

煙草是雙子葉植物綱（Dicotyledoneac）管花目（Tubiflorae）茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana），多為一年生草本，是我國重要的經濟作物。煙草主莖的高度從十幾厘米到幾百厘米。單葉互生，有葉柄或無葉柄，葉形變化較大。聚傘狀花序，花色有黃色、白色、紫色、紅色等。管狀或鐘狀花萼，管圓筒形花冠。5 枚雄蕊著生于花冠基部，子房三室或四室。每個蒴果約有 2000粒種子。莖、葉和花萼都有腺毛，能分泌粘液。最重要的是大多數煙草屬植物能產生一種特有的生物堿，含量在 0.5 %-10 %，煙草中生物堿的組成和含量是衡量煙葉品質的重要指標之一。煙堿的生物合成，煙堿和降煙堿之間轉化的調控機制，一直是煙草研究熱點。研究將利用基因工程技術，進一步闡述降煙堿代謝調控的分子機制，為煙草的“降焦減害”提供理論基礎。

危害^[1]

煙堿（nicotine）是普通煙草（Nicotiana tabacum L.）中主要的生物堿，占生物堿總含量的 90 ％-95 ％，降煙堿含量通常低于生物堿的 5％。但一些白肋煙和烤煙品種在成熟和加工過程中會將煙堿轉化為降煙堿，使降煙堿成為含量最高的生物堿。高溫條件下降煙堿生成麥斯明（myosmine）和取代吡啶化合物，影響煙草的本來香味。此外對人體健康有危害，是潛在致癌物質亞硝基降煙堿（nitrosonornicotine，NNN）的合成前體，降煙堿本身也能直接誘導吸煙者血漿中蛋白的異常糖基化，與類固醇類藥物發生共價反應，影響藥效和毒性。

含量測定^[2]

降煙堿是卷煙煙絲中的主要生物堿之一，對卷煙品質有重要影響，并是煙草特有亞硝胺——亞硝基降煙堿（NNN）的前體物質。降煙堿分子含有一個手性中心，所以降煙堿有兩個對映體：S-(-)-降煙堿（簡稱S-降煙堿）和R-(+)-降煙堿（簡稱R-降煙堿）。根據對映異 構體的特性，降煙堿的兩個對映對映體可能具有完全不同的代謝機理和生理特性。因此，有必要對卷煙煙絲中降煙堿的對映異構體含量進行分析測定。目前，文獻報道降煙堿對映異構體的測定方法主要有氣相色譜-質譜聯用法、多維氣相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法等，但是，GC-MS和MDGC-MS需要 在前處理過程中進行衍生化，費時費力，CE僅使用保留時間進行定性，定性能力相對較差，容易出現假陽性結果。因此有必要開發一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準確定量卷煙煙絲中S-降煙堿和R-降煙堿的方法。基于上述技術不足，有研究建立了一種合相色譜-串聯質譜法測定卷 煙煙絲中降煙堿對映異構體含量的方法。本方法在前處理過程中不需要衍生化過程，實現了S-降煙堿和R-降煙堿的基線分離，并使用二級質譜進行定性和定量，避免出現假陽性結果，所以，本方法具有操作簡便、靈敏度高、準確定好等優點。通過以下技術方案來實現的：將卷煙煙絲樣品干燥、粉碎和過篩，樣品經過氫氧化鈉溶液浸潤后，采用二氯甲烷萃取，萃取液經基質分散固相萃取凈化后，使用串聯手性柱-合相色譜-串聯質譜法分析，采用峰面積歸一化法定量檢測卷煙煙絲中S-降煙堿和R-降煙堿的比例。具體步驟如下：

1）標準溶液的配制：稱取約100.0 mg的S-(-)-降煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中， 配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-降煙堿標準儲備液；稱取約100.0 mg的R-(+)-降煙堿 標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的R-(+)- 降煙堿標準儲備液；利用S-(-)-降煙堿標準儲備液和R-(+)-降煙堿標準儲備液稀釋配制S- (-)-降煙堿和R-(+)-降煙堿濃度分別為100 μg/mL和100 μg/mL的混合標準溶液

2）卷煙煙絲樣品的混勻：將卷煙煙絲樣品置于40 ℃烘箱中，1小時后將卷煙煙絲取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

3）卷煙煙絲樣品的萃取：選擇正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷五種溶劑進行萃取效率的比較。結果發現，二氯甲烷對降煙堿的萃取效率最高，甲基叔丁基醚和乙酸乙酯次之，正己烷和三氯甲烷的萃取效率最差，故選擇二氯甲烷為最終的萃取溶劑。優化的萃取步驟為：稱取0.3 g已粉碎的樣品于15 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5%的氫氧化鈉溶液（質量比），渦旋1 min混勻后靜置10 min浸潤樣品，取10 mL二氯甲烷到離心管中，并于旋渦混合 器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

4）萃取液的凈化：取1.5 mL上清液于2 mL凈化離心管中（內含150 mg無水硫酸鎂，50mg PSA吸附劑，25 mg GCB吸附劑，統稱基質分散固相萃取材料），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以 10000 rpm離心1 min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜后進液相分析。

5）串聯手性柱-合相色譜-串聯質譜法條件：分析柱1為Trefoil CEL1柱（柱長 150 mm，內徑3.0 mm，固定相粒徑2.5 µm），分析柱 2為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm，內徑4.6 mm，固定相粒徑5 µm)；流動相A 為：CO2，流動相B：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫條件為：0.0 min， 97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；12.0 min，92% A； 30.0 min，90% A。柱溫40 ℃；進樣室溫度：10 ℃；進樣體積2 μL；背壓：1600 psi；ISM補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3 mL/min。分析時間總計30 min。質譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300 ℃，電噴霧電壓為5000 V，霧化氣壓力為40 psi；檢測方式：多反應監測（MRM）；。通過對峰面積進行歸一化定量S-降煙堿和R-降煙堿占總降煙堿的比例。

6）檢出限和定量限：在優化條件下，按照目標物信噪比為3時對應的濃度作為檢出限，按照目標物信噪比為 10時對應的濃度作為檢出限。S-降煙堿的檢出限和定量限分別為0.12 μg/g和0.40 μg/g， R-降煙堿的檢出限和定量限分別為0.12 μg/g和0.40 μg/g。

7）精密度：取同一卷煙煙絲樣品進行5次日內和日間平行測定，考察了上述方法的精密度，結果表明，卷煙煙絲樣品中S-降煙堿的日內和日間測定結果的變異系數分別為1.08%和2.45%，精密度較好。

主要參考資料

[1] 煙草（Nicotiana tabacum L.）降煙堿代謝調控的分子機制研究

[2] CN201710698782.4一種合相色譜?串聯質譜法測定卷煙煙絲中降煙堿對映異構體含量的方法