57-13-6/尿素的檢測方法

背景及概述^[1][2]

尿素又名脲或碳酰胺。無色晶體。熔點132.7℃。比重1.335(20/4°)。溶于水和乙醇。為人和哺乳動物體內蛋白質代謝的一種最終產物，也是動物體排出的一種主要的有機氮化物。在海洋環境中普遍存在，主要來自海洋動物的排泄和異養微生物對蛋白質、氫基酸的分解；人類活動對近岸海域也有一些輸入。尿素是浮游植物可利用的一個氮源；在化學上能參與多官能團縮聚物的形成。在海水中的濃度隨浮游植物的盛衰而波動，但代表性的濃度值為5微克碳/升。尿素是氨基酸代謝的最終產物，在肝內合成，可自由地從腎小球濾出，40%—50%在腎小球的髓質部被動的重吸收，據有關文獻報道：當人體尿素的含量超過了自身的吸收能力之后，將會對人體的肝、腎、肺泡等造成危害。

應用^[2]

尿素是一種優質、高效的重要氮肥，適用于各類作物。也可作反芻動物的補充飼料。工業上尿素是合成脲醛、三聚氰胺-甲醛樹脂等的原料。醫藥上用于制造四環素、苯巴比妥、咖啡因等藥物。染料工業用它生產還原棕BR、酞青藍B等。

尿素在土壤中的行為^[3]

尿素施入土壤中，在脲酶作用下，水解成NH+4和NH3，NH3在石灰質土壤的旱田中或pH值高的水田中，易造成NH3的揮發損失；在NH+4存在下，促使土壤中硝化細菌大量繁殖，而將NH+4轉化為NO-3。雖然，NH+4、NO-3均為作物所需要的氮源，但NH+4易于被土壤膠粒所吸附，而NO-3則隨雨水或不當的灌溉水所淋失。此外，土壤中的反硝化細菌還能將NO-3還原為NO-2，并進一步轉化為NO、NO2、N2而造成氮的損失。這些過程均隨氮肥過量施用而加劇。因此，選擇適宜的脲酶抑制劑和硝化抑制劑以抑制脲酶和硝化細菌等微生物菌群的活性，選擇適合的限制溶解物質，或者在尿素顆粒表面包覆一層膜，以限制尿素的溶解，可以減緩尿素溶解和分解的速率，使尿素有效期延長，減少損失，提高尿素利用率。

檢測方法^[4]

目前，國內外對尿素的測定方法有很多，歸納起來主要有以下幾種：直接比色法、間接比色法、色譜法、中紅外光譜法等。

1. 直接比色法

直接比色法即用某種特殊試劑與尿素直接作用，產生顯色反應，然后在特定的波長下用分光光度計測定其吸光度，再換算成尿素含量。較常用的直接比色法有二乙酰一肟法、鄰苯二甲醛法、對二甲氨基苯甲醛法3種，而亞硝酸鹽-格里斯試劑法在現階段只能定性不能定量。

1）二乙酰一肟顯色法

二乙酰一肟顯色法也叫丁二酮一肟法，該方法的原理是：在強酸加熱條件下，尿素與二乙酰發生Fearon反應，生成紅色的原二嗪(Diazine)，顏色深淺與尿素含量成正比。因二乙酰不穩定，常用二乙酰一肟代替，二乙酰一肟遇酸水解成二乙酰。本法的顯色反應中產生的復合物對光不穩定，目前已經有研究證實向試劑中添加一定濃度的安替比林、硫脲、金屬離子等能提高尿素與雙乙酰反應的靈敏度，又能增加其顯色的穩定性。該方法所用試劑易得，且成本低，但在操作時需加熱煮沸，且線性范圍狹窄，所用試劑具有毒性和腐蝕性，易污染環境。所以該方法只適用于實驗室規范操作下進行，一般不適用于現場快速檢測。

2）鄰苯二甲醛法

鄰苯二甲醛比色法，該方法原理是：在酸性環境中，尿素與鄰苯二甲醛的結合物作用于安替比林生成黃色化合物，后者與偏釩酸根結合后呈深藍色，色澤深淺與尿素含量呈正比。根據研究，鄰苯二甲醛是顯色劑，4-氨基安替比林做加速劑，偏釩酸銨做轉色劑。其中，4-氨基安替比林和偏釩酸銨的用量對反應速率和顯色程度起到關鍵性的作用。該法不需煮沸，線性可達60mmol/L，精密度和準確度及相關性都很好，而且不需特殊儀器和特種試劑，成本低，可實現自動化分析，試劑穩定可室溫保存，且變異系數小，干擾因素少，實踐證明該法不失為經濟、實用、值得推廣的尿素測定技術。但該法的靈敏度較低，對于溶液中微量的尿素不容易檢出。而該法在檢測尿素含量小于3.0mg/L時靈敏度不夠，故此方法在檢測尿素濃度較低的樣品時有一定局限性。

3）對二甲氨基苯甲醛法

對二甲氨基苯甲醛(PDAB)比色法，該方法原理是：在酸性溶液中，尿素與對PDAB發生Ehrlich反應，生成對二氨基苯甲醛脲，該物質呈檸檬黃色，顏色深淺與尿素含量成正比。該法最佳顯色溫度為25—30℃，最佳顯色時間為5min。根據文獻資料顯示，該法中PDAB用量控制至為重要。該法在尿素濃度4—60mg/L范圍內線性良好，穩定性好，干擾少以及操作簡便，是測定常量尿素的良好方法。由于該方法的靈敏度不高，一般用于乳制品、飼料等食品方面尿素的檢測，廢水中也有用該法測定尿素。

4）亞硝酸鹽-格里斯試劑法

尿素與亞硝酸鹽在酸性溶液中發生反應生成氮氣逸出，而格里斯試劑可以與亞硝酸鹽發生偶氮反應生成紫紅色染料。因此將待測的樣品溶液與一定的亞硝酸鹽在酸性條件下反應一段時間后，再加入格里斯試劑，通過溶液顏色與標準液的顏色的比較來判斷是否有尿素存在。該方法主要用在乳制品尿素的檢測當中，用于尿素的定性，在朱秀高[15]等人的研究下，改良了格里斯試劑，省卻了用強酸，并且能夠在常溫下進行反應，反應時間也縮短為10min，減少了假陰性結果的出現，反應的靈敏度為0.2%，但是目前仍然沒有用此方法定量檢測尿素的報道。

2. 間接比色法

間接比色法就是通過檢測尿素在酶解后的產物，再換算成尿素含量。已知尿素在脲酶存在的情況下會發生以下反應：

在一定的條件下，生成的NH+4和CO2的量與尿素的濃度成正比，一般都是通過用分光光度法檢測氨的含量來間接檢測尿素的含量。脲酶的本質是蛋白質，在37℃下活性最大，且隨著溫度、水等的變化，脲酶的活性也會發生重大變化，故該方法有一定局限性。如游泳水中經常會加入的抑藻劑硫酸銅，銅離子會導致脲酶失活而嚴重干擾測定，通過實驗證明在樣品中加入二乙基二硫代氨基甲酸鈉-氯仿能夠去除銅離子，避免了銅離子干擾。同時，另有實驗發現，泳池水中的余氯會影響脲酶活性干擾測定，暫未研究出合適的掩蔽方法。這一類的研究也在逐年增加。現在常用的間接比色法有如脲酶-波氏比色法、酶偶聯法、甲酚紅法、酶電極法等。

1）酶偶聯法

脲酶分解尿素產生的氨在T-酮戊酸和還原型輔酶I(NADH)存在下，經谷氨酸脫氫酶(GLDH)催化生成谷氨酸。同時，NADH被氧化成氧化型輔酶I(NAD)。NADH在340nm波長處有吸收峰，其吸光度下降的速度與待測樣品中尿素的含量成正比。此法優點是特異性高快速、結果準確精密，是目前測定尿素的首選化學方法。2011年頒布的中華人民共和國衛生行業標準中血清尿素測定參考方法也是用谷氨酸酶偶聯法，但是該法所用的試劑價格昂貴，且溶解后很不穩定，多需紫外分光光度計，不適于手工和急診分析。

2）脲酶-波氏比色法

脲酶水解尿素，產生NH+4和CO2。在堿性條件下，亞硝基鐵氰化鈉催化NH+4與酚及次氯酸根反應生成藍色化合物。該方法目前目前應用的領域較廣，包括臨床醫學、環境等領域。李建元[20]指該法與以前用的二乙酰一肟法相比，能有效縮短反應時間，靈敏度高，線性良好，精密度好，不需要避光處理。其精密度和準確度在測定游泳池水尿素方面均能達到國標要求。因此，脲酶-波氏比法測定尿素具有操作簡便，反應時間短，測定結果具有較高的精密度和準確度。

3）酶電極法

它是基于脲酶水解尿素產生NH+4，NH+4使溶液的電導率發生改變，利用特定電極測定電導率的變化來測定樣本中尿素含量的酶電導法。在方法學上未采用比色分析，因此，其他許多潛在干擾物質對測定的影響也大大減少。本法反應時間僅需11.5s，是目前測定尿素方法中最快的方法，保養簡單，更適合現場快速檢測分析。在2008年在臨床上進行了尿素生物傳感器的開發，將脲酶吸附在聚乙烯醇(PVA)和聚丙烯酰胺(PAA)的復合聚合物膜上，然后在V射線的照下誘導自由基聚合生成生物膜，響應時間為120s，工作范圍在1—1000mmol之間，雖然測定時間延長了，但是該膜能在含有二硫蘇糖醇、U-巰基乙醇和甘油的磷酸緩沖溶液中保存三個月以上，克服了以前酶電極壽命短的問題。

4）甲酚紅法

應用甲酚紅法測定尿素的主要原理是尿素在脲酶水解作用下產生氨而使溶液pH升高，引甲酚紅溶液顏色發生相應變化，從而根據顏色是否發生改變及深淺來定性半定量溶液中尿素的有無和含量。當前研究一致認為該方法具有簡單、快速、靈敏等優勢，因而可以在樣品快速測定中予以推廣使用。但是該方法要在堿性環境下才能顯色，而一般脲酶在偏酸性環境下活性最佳，在堿性條件下，脲酶活性不高甚至失活，故該方法存在一定局限性。

5）鄰甲酚酞絡合劑法

根據脲酶水解尿素后產生的氨，使溶液中氫離子濃度發生變化這一原理，在一定緩沖體系中，以鄰甲酚酞絡合劑來比色定量溶液中氫離子濃度的變化。以鄰甲酚酞絡合劑(OCPC)作為顯色劑，在波長570nm下吸光度變化與尿素濃度成正比。用該法測定血清，操作簡便，顯色穩定性好，線性范圍為0.00—100mmol/L，檢出限為0.36mmol/L。該法靈敏、簡便、準確、線性范圍廣，適用于自動分析。但是該法隨緩沖液的濃度變化關系很大，緩沖液濃度偏高，減低了靈敏度，偏低線性范圍下降，同時影響反應體系抗酸堿能力。

6）甲基麝香草酚藍法

脲酶水解尿素產生的氨，使溶液pH升高，pH升高的幅度與尿素含量呈線性關系，以甲基麝香草酚藍作為顯色劑檢測溶液pH的變化，從而推算出尿素的含量。

7）ATP水解酶法

利用尿素氨基水解酶(ATP水解酶)對尿素濃度進行測定，該方法原理是尿素和ATP發生以下的水解反應：

檢測定量限可達5μmol/L，具有很高的檢測靈敏度。

3. 色譜法

色譜分析方法具有高速、高效、高靈敏等特點，適用于復雜混合物的分離，實現多組分的同時測定，被廣泛應用于環境監測、食品、農業等領域。經文獻的查閱，色譜法測定尿素主要是基于液相色譜相關聯的技術。

1）高效液相色譜-熒光檢測器法

在近來通過測定尿素與次溴酸在一定條件下反應產生的發光體，結合熒光檢測器的高效液相色譜法側耳尿素的濃度，該方法主要運用在臨床上，但是該方法目前來說精確性一般，線性相關系數r只達到0.93，且存在干擾，故該方法還需要進一步改進。

2）液相色譜同位素稀釋串聯質譜法

以尿素同位素標記物(Urea-13C，15N2)為內標，ZORBAXRX-SIL為色譜分離柱，乙腈溶液為流動相，使用電噴霧三重四級桿串聯質譜的多重反應監測模式測定，以及同位素稀釋的括號法進行定量。在血清尿素檢測中，該法前處理操作簡單、快速，不需進行復雜的衍生化反應且定量準確，重復精度高。采用美國NIST血清標準物質進行驗證，測定結果與標準值的相對偏差小于0.5%，證明了該法具有較高準確性。

4.中紅外光譜法

中紅外光譜法分析技術具有無需對樣品處理、成本低、試樣用量少、對樣品無損檢測等特點，適合分析各種狀態的試樣。采用中紅外光譜技術檢測了牛奶中尿素，以尿素在牛奶中兩個吸收峰的比值與牛奶中尿素濃度之間的關系實現對牛奶中尿素的定量分析。該方法線性相關系數r雖能達到0.96以上，但是準確度方面還有較大缺陷，不過這為尿素的現場快速檢測奠定了實驗基礎。

制備^[2]

工業上用液氨和二氧化碳在180～200℃，15～20MPa的條件下直接合成。反應分兩步：先生成氨基甲酸銨，然后脫水而得尿素。反應式如下：

實際生產中兩步都在合成塔內連續進行。為提高產率，氨過量0.5～2倍。反應(2)進行得不完全，反應約1h，氨基甲酸銨轉化率只有70%，這時合成塔中的物料除尿素和水外，還有未反應的物料氨基甲酸銨和過量的氨，將未反應的物料分離出去，余下尿素水溶液進一步加工得到固體成品。若將未反應的物料部分送回原合成系統循環使用，另部分加工成其他氮肥，這種工藝路線稱為“半循環法”，氨利用率為42%～73%。若將未反應的物料全部送回合成系統循環使用，則稱為“全循環法”，氨利用率高達98%。近年來，世界各國新建的尿素廠，絕大多數采用全循環法生產工藝。

主要參考資料

[1] 海洋化學辭典

[2] 中國成人教育百科全書·化學·化工

[3] 緩釋和控釋尿素的研究與開發綜述

[4] 尿素檢測方法的研究進展及其快速檢測產品現狀