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薯蕷皂素（Diosgenin）來源于薯蕷科單子葉草質纏繞藤本植物,如山藥、黃姜、黃藥子、穿山龍等的根莖,是生產氫化可的松、強的松、炔諾酮、膚輕松、地塞米松等多種甾體類藥物的重要基礎原料。研究表明,薯蕷皂素具有抗氧化、抗血管鈣化、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗病毒和抗休克等作用。
薯蕷皂素在生殖方面的研究,報道甚少,有研究初步證實,薯蕷皂素能夠改善輕度雄性衰老性生殖障礙,提高精子活性;但薯蕷皂素對睪丸支持細胞（Sertoli cells,SCs）作用的研究還未見報道。因此,進一步研究薯蕷皂素對雄性生殖的影響,可能為男性不育防治提供新的思路。SCs在精子生成過程中,可以在近基底室建立一個提供結構支撐、營養和免疫保護的獨特和重要的環境,具有營養支持、分泌、免疫豁免及吞噬等多種功能。由于雌激素在維持雄性生殖活動中具有不可替代的作用。
SCs是未成熟動物雌激素的主要來源,雌激素不僅可以直接促進SCs的增殖、分化和成熟,而且可以通過間接影響促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone,FSH）的分泌,調節SCs有絲分裂;同時,又由于雌激素主要是通過其受體（Estrogen receptor,ESR）信號通路來完成調控男性精子生成的作用。因此,研究薯蕷皂素對SCs的作用及其對ESR信號傳導途徑的影響,不僅為探討該藥治療男性不育的作用及機制,而且為其進一步藥物研發提供實驗依據。第一部分:薯蕷皂素對SCs增殖的影響目的:通過觀察薯蕷皂素干預后,小鼠睪丸來源的SCs（TM4）細胞系的增殖、周期分布及凋亡,探討薯蕷皂素對SCs增殖的影響。
方法:
1)MTT法及Brdu法檢測薯蕷皂素干預后,SCs（TM4）的增殖情況。
2)流式細胞術及Western Blot法檢測薯蕷皂素干預后,SCs（TM4）的周期分布及G0/G1期標志蛋白CDK4/CDK6、cyclin D1、CDK2、cyclin E與G2/M期標志蛋白cdc2、cyclin B的表達。
3)TUNEL法及Western Blot法檢測薯蕷皂素對干預后,SCs（TM4）凋亡及凋亡相關蛋白Bax、AIF、Caspase 3、Caspase 9和Bcl-2的表達。
結果:
1)不同薯蕷皂素濃度均可促進SCs（TM4）增殖（P<0.05）,以2.5μM最為顯著;2.5μM薯蕷皂素干預SCs（TM4）6-48 h,在6、12、24、48 h等不同時間點均可見細胞活力增加（P<0.05）,但以24h時達最大值。
2)2.5μM薯蕷皂素干預SCs（TM4）24h,G0/G1期細胞數量明顯減少（P<0.05）,而S期的細胞群顯著增加（P<0.05）,G2/M期細胞群沒有顯著改變（P>0.05）;G0/G1期的標志蛋白CDK4/CDK6、Cyclin D1、CDK2與Cyclin E表達明顯增加（P<0.05）,而G2/M期標志蛋白cdc 2和Cyclin B表達無顯著影響（P>0.05）。CDKs抑制因子P27的表達稍有下降（P>0.05）。
3)2.5μM薯蕷皂素干預SCs（TM4）24 h,能顯著抑制細胞凋亡（P<0.05）;明顯抑制凋亡相關因子Bax、AIF、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase 9的表達,增加Bcl-2蛋白表達（P<0.05）。
結論:薯蕷皂素能夠促進小鼠SCs（TM4）的增殖,且存在一定的量效與時效關系;同時促進其細胞周期過渡和抑制其凋亡。第二部分:薯蕷皂素調控ESR及其ERK/Akt信號通路促進SCs增殖的機制目的:通過觀察薯蕷皂素對SCs（TM4）中ESR及其ERK/Akt信號通路的影響,探討其促進SCs增殖的機制。
方法:
1)以2.5μM薯蕷皂素干預,及在此基礎上分別加入1n M抗雌激素ICI和5n M酪氨酸激酶選擇性抑制劑PP2,Western Blot法檢測SCs（TM4）核和質膜中的ESR1、ESR2的蛋白表達。MTT和Brdu標記法、流式細胞術、TUNEL法檢測SCs（TM4）的增殖、周期分布及凋亡。
2)薯蕷皂素干預SCs（TM4）后,及在薯蕷皂素干預的基礎上,分別加入ICI、PP2及ERK抑制劑U0126及和Akt抑制劑LY294002后,Western Blot法檢測不同時間點ERK和Akt磷酸化;MTT和Brdu標記法檢測SCs（TM4）的增殖。
3)薯蕷皂素干預后,采用Wstern Blot法檢測SCs（TM4）細胞核上ESR表達;熒光素酶報告基因檢測SCs（TM4）的ESR的轉錄活性。
4)CHIP檢測薯蕷皂素干預后,SCs（TM4）ESR的晚期活動。
結果:
1)2.5μM薯蕷皂素干預SCs（TM4）0-30min,在5min、15min、30min時間點質膜上ESR1和ESR2蛋白表達均有顯著升高（P<0.05）,在15min時達到最高;而核上ESR1和ESR2的蛋白表達顯著降低（P<0.05）,在15min時達到最低。加入ICI和PP2時,ESR1、ESR2細胞膜表達水平受到了顯著抑制（P<0.05）;而細胞核上ESR1、ESR2的核表達水平明顯升高（P<0.05）。在加入ICI和PP2時,薯蕷皂素促進SCs（TM4）增殖的作用受到了顯著的抑制（P<0.05）;同時,G0/G1期細胞群數量有明顯上升（P<0.05）,S期的細胞群數量有明顯下調（P<0.05）;細胞的凋亡有顯著增加（P<0.05）。
2)2.5μM薯蕷皂素干預SCs（TM4）0-30min,在5min、15min、30min時均可增加ERK、Akt磷酸化水平,15min時達到最高（P<0.05）。分別加入相關抑制劑ICI、PP2、U0126及LY294002時,ERK、Akt磷酸化水平受到顯著抑制（P<0.05）;加入U0126及LY294002時,SCs（TM4）的細胞增殖降低（P<0.05）。
3)2.5μM薯蕷皂素干預0-48h,在12h、24h、48h時間點SCs（TM4）細胞核ESR1與ESR2的表達增加,其中以干預后24h增加最為顯著（P<0.05）;在此基礎上加入PP2時,細胞核上ESR1、ESR2的核表達水平顯著升高（P<0.05）;同樣條件下,SCs（TM4）的ESR轉錄活性顯著增加（P<0.05）,以干預后24h增加最為顯著;而在加入抑制劑ICI、PP2、U0126和LY294002后SCs（TM4）的ESR轉錄活動受到顯著抑制（P<0.05）。
4)2.5μM薯蕷皂素干預SCs（TM4）后ESR1、ESR2蛋白分子與Cyclin D1及Bcl-2基因結合水平增高顯著（P<0.05）。
結論:薯蕷皂素促進SCs（TM4）增殖機制:干預后激活依賴于SRC誘導的即時和瞬態ESR核質膜易位,隨后激活ERK/Akt信號通路,后期通過活化核ESR的轉錄活性和直接調控細胞周期因子cyclin D和細胞凋亡因子Bcl-2,從而促進G1期到S期的細胞周期過渡和抑制細胞凋亡,最終導致細胞增殖。
【1】吳雷濤. 薯蕷皂素調控ESR及其ERK/Akt信號通路促進SCs增殖的機制研究[D].第四軍醫大學,2015.