50-91-9 / 2-去氧氟尿苷的制備方法

背景及概述^[1]

天然核苷是由核糖或脫氧核糖與天然堿基所形成，由于天然堿基的多樣性，構成的核糖核苷或脫氧核糖核苷也是種類繁多。天然核苷中的堿基或糖基經過化學修飾形成新的核苷，這種經過人工合成的核苷即為核苷類似物。核苷類似物與核苷酸在化學結構上具有類似性，可以假亂真混入DNA合成的過程中，但因其不具備核苷酸的功能，所以導致合成的核酸鏈失去了正常的功能。通過氮雜、脫氮、取代等化學修飾方法，對正常堿基的嘧啶和嘌呤進行修飾就可得到核苷類藥物。核苷類似物在病毒或腫瘤細胞的遺傳物質表達的過程中，被整合到DNA鏈中，不僅大大降低了聚合酶的活性，也終止了DNA的合成，從而使病毒細胞無法增殖傳代，導致病毒的滅亡。因此，核苷類藥物在治療艾滋病毒、乙肝病毒、腫瘤等領域表現出極大的優勢。據統計，在目前使用的抗病毒藥物中有將近50％是核苷類藥物。

核苷類藥物中的5-氟尿苷是一種重要的5-氟嘧啶類衍生物，可以制備多種抗癌抗病毒藥物，特別是可以做為抗腫瘤新藥氟鐵龍(DFUR)的前體。2-去氧氟尿苷為脲嘧啶類抗代謝物，屬細胞周期特異性抗腫瘤藥，可抑制胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶，阻斷脲嘧啶脫氧核苷酸轉變成胸腺嘧啶核苷酸，從而影響DNA的合成，起到抗病毒和抗腫瘤的作用。該藥對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，臨床上主要用于治療肝癌、胃腸系癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等，與常用抗腫瘤藥物5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)相比，具有低細胞毒性和易于在體內被吸收的優點。現有技術中，常采用化學法糖基化得到脫氧氟尿苷，產物中會出現多種同分異構體，并且合成步驟繁多，需要對堿基或核糖基上的活性基團進行修飾保護，且合成過程中大量使用有機溶劑，同時還要使用毒性較大的氟化物、溴化物、重金屬等，對環境造成巨大的污染。核苷磷酸化酶可以催化核苷或脫氧核苷的糖苷鍵的可逆磷酸化反應，提供核糖-1-磷酸，并釋放堿基，加入其它堿基可形成另一種新的核苷。因此，核苷磷酸化酶主要用作酶法合成核苷類似物的工具。但是，現有核苷磷酸化酶的轉化率較低，制備核苷類藥物的成本較高。。

制備^[1]

2-去氧氟尿苷的制備如下：以核苷磷酸化酶PyNP為催化劑，采用不同的核糖供體和堿基受體，制備5-甲基尿苷、5-氟尿苷、5-氮胞苷、5-氟胞苷、胸苷、2-去氧氟尿苷、2’-脫氧-5-氮胞苷、2’-脫氧-5-氟胞苷、2’-脫氧-5-氟尿苷、2’-脫氧-5-氟胞苷、2’-脫氧-5-氟胞苷、2’-脫氧-5-甲基尿苷、阿糖-5-氟尿苷、阿糖-5-氮胞苷和阿糖-5-氟胞苷。在1ml的pH8.0、80mM的磷酸緩沖液中(含有1mM的EDTA)，分別加入終濃度為60mM的核糖供體和終濃度為30mM的堿基受體，加入終濃度為1.5U/mL純化后的核苷磷酸化酶，在50℃、轉速為900rpm的恒溫振蕩反應器中反應。反應3h后，取50μl樣品加入到950μl甲醇中以終止反應，利用高效液相色譜HPLC檢測產物。檢測條件：利用AgilentTC-C18的檢測柱，流動相為甲醇：水＝95：5，檢測波長為254nm，柱溫為30℃，流速為1ml/min。根據峰面積計算底物的轉化率。其中核糖供體為尿苷、2’-脫氧尿苷、胸苷、2’，3’-雙脫氧胸苷或阿糖尿苷。堿基受體為5-甲基脲嘧啶、胸腺嘧啶、5-氟脲嘧啶、5-氮胞嘧啶或5-氟胞嘧啶。

主要參考資料

[1] CN201610218675.2一種核苷磷酸化酶、編碼基因及其高產菌株和應用