31282-04-9 / 潮霉素B在生物領(lǐng)域應(yīng)用與使用說(shuō)明

潮霉素B通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成而殺死細(xì)菌、真菌和高等真核細(xì)胞。通過(guò)干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對(duì)mRNA模板的錯(cuò)讀而抑制蛋白合成，從而殺死原核（如細(xì)菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞。目前常用于篩選和維持培養(yǎng)含潮霉素抗性基因的原核或真核細(xì)胞。潮霉素B可溶于甲醇、乙醇和水，但在乙醚、氯仿或苯中都幾乎不溶。

潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，大腸桿菌（ Escherichia coli.）來(lái)源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶，將潮霉素B轉(zhuǎn)化成不具有生物活性的磷酸化產(chǎn)物，從而起到解毒作用。針對(duì)這一原理，潮霉素B是一種非常有用的選擇性標(biāo)記，用來(lái)篩選和維持培養(yǎng)成功轉(zhuǎn)染潮霉素抗性基因的原核或者真核細(xì)胞。另外，由于作用模式的差異，常與G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和Blasticidin S聯(lián)合使用進(jìn)行雙抗性陽(yáng)性細(xì)胞株的選擇。潮霉素B還能用作抗病毒劑，因其選擇性滲透進(jìn)入因病毒感染增強(qiáng)通透性的細(xì)胞，且具有抑制翻譯的功效。還可混合入動(dòng)物飼料中起到驅(qū)蟲(chóng)功能。

潮霉素B在20世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)用作動(dòng)物用藥。而現(xiàn)在它仍然作為驅(qū)蟲(chóng)抗蟲(chóng)藥被加入雞和豬的飼料中。用于產(chǎn)生潮霉素的吸水鏈霉菌在1953年被首次從土壤中分離并獲得純培養(yǎng)。潮霉素B相關(guān)的抗性基因發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代早期。

抗性基因：對(duì)潮霉素B的抗性源自編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hph）的基因。至今發(fā)現(xiàn)兩種來(lái)源。
i.Streptomyces hygroscopicus產(chǎn)生的Hph抗性基因；
ii.Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae內(nèi)質(zhì)粒攜帶的Hph抗性基因（常用）。

二、潮霉素B的應(yīng)用
1.篩選和維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hph 載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞（植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）；
2.由于作用模式的差異，常與G418 （GeneticinTM），Zeocin™和blasticidin S聯(lián)合使用，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩個(gè)不同載體的細(xì)胞株；
3.抗病毒劑，由于潮霉素B選擇性滲透進(jìn)入因病毒感染增強(qiáng)通透性的細(xì)胞，而且具有抑制翻譯的功效；
4.作為驅(qū)蟲(chóng)藥加入動(dòng)物飼料；
5.雙抗性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選的抗生素作用機(jī)制及抗性
6.抗生素抗性機(jī)制抗性基因哺乳動(dòng)物篩選濃度
i.潮霉素B干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對(duì)mRNA模板的錯(cuò)讀Hph 200~500μg/mL；
ii.G418干擾80S核糖體功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn60 1100~1000μg/mL；
iii.Zeocin摻入或者切割DNA引起細(xì)胞死亡Sh ble 50~100μg/mL；
iv.blasticidin S核糖體上抑制肽鍵形成Bsd/BSD 3~50μg/mL。
7.羅氏潮霉素B應(yīng)用濃度
潮霉素B用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL，最佳濃度需要?dú)缜€來(lái)確定。
i.哺乳動(dòng)物細(xì)胞·200-500 μg/mL；
ii.細(xì)菌/植物細(xì)胞·100-300 μg/mL；
iii.真菌·300-1000μg/mL。

三、潮霉素B的使用步驟
1.案例一：殺滅曲線確定最佳殺死濃度（僅作參考）
i.往組織培養(yǎng)級(jí)的96孔板內(nèi)加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞密度約50-200細(xì)胞/孔；細(xì)胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度（如50-1000μg/mL，至少5個(gè)濃度）潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基；
ii.37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞10-14天；
iii.培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)含有相應(yīng)濃度的潮霉素B；
iv.10-14天后使用細(xì)胞增殖方法如MTT，CCK-8等評(píng)估細(xì)胞活力；也可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù)或百分比匯合率來(lái)確定毒性效應(yīng)。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細(xì)胞的最小濃度為最佳篩選濃度。
2.案例二：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞
i.對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸去60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml；對(duì)于懸浮細(xì)胞，無(wú)菌條件250x g,離心10min除去舊的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基；
ii.5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基；
iii.再孵育細(xì)胞5-7天；
iv.10-14天孵育后，培養(yǎng)體系中只含有能夠表達(dá)潮霉素B抗性表型的活細(xì)胞。因此篩選之后如步驟一，更換不含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。

四、保存方法：溶液直接存放在2℃～8℃，至少存放1年。