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D-熒光素是一種依賴腺苷三磷酸(ATP)生物發光反應的底物，生物發光的原理是熒光素在ATP和氧存在條件下被熒光素酶氧化，其化學反應式如下： ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light。熒光素/熒光素酶的生物發光反應常用于ATP、能轉化為ATP的代謝物(如AMP、ADP、cAMP)和能產生ATP的酶(如肌酸激酶等)的檢測，因此生物發光反應可應用于廣泛范圍內生物材料的檢測。近幾十年來，ATP 生物發光技術得到了很大的發展，已經在細胞增殖、細胞毒性和生物量計數等方面廣泛應用。 在食品衛生領域由于ATP生物發光技術無需培養過程，操作簡便、靈敏度高，數分鐘內可得 到結果，具有其它微生物檢測方法無法比擬的優勢，是目前檢測微生物最快的方法。除此之外，熒光素酶基因可作為報告基因，在分子生物學上有廣泛的應用。因此熒光素/熒光素酶生物發光反應具有很大的市場，D-熒光素作為生物發光反應的底物，隨著ATP生物發光反應試劑需求的增加，其需求量越來越大。
D-熒光素的反應原材料為2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(99％，NEW JERSEY，USA 1-800-ACROS-01)和鹽酸吡啶(98％，ACROS ORGANICS)，反應比例為2-氰基-6-甲氧基苯 并噻唑∶鹽酸吡啶＝1∶1～3，反應溫度為180～250℃，環境為抽真空通氮氣，反應時間為0.5～3h。
脫甲基反應后的產物用1∶1～3的乙酸乙酯和冰水洗滌反應后的混合物三次，每次的用量 約為反應原材料的50～100倍。通過萃取有機層后用旋轉真空蒸發儀進行濃縮干燥。
脫甲基后的目標產物純化是用80～400目的粗孔硅膠進行柱層析，層析柱最好用帶三通的 可加壓式層析純化柱。用體積比5∶1～3氯仿/乙酸乙酯做洗脫溶劑，對直徑為25mm，高為 250mm的層析柱，洗脫流速為1～10ml/min，通過HTLC(高效薄層層析)檢測，收集目標產 物濃度的較高部分，合并之后進行旋轉真空蒸發濃縮干燥。
純化后的脫甲基產物與D-半胱氨酸水合物在堿性混合溶劑中于室溫下避光反應 10～30min，用鹽酸調pH值至1～6，通過1000～15000r/min室溫條件下離心10～20min，收集 沉淀，并將此沉淀在真空條件下干燥，即可得D-熒光素粗品。
CN201410013473.5公開一種檢測飲用水中衛生質量和GMP工廠表面衛生的ATP生物發光試劑、方法及試劑盒。本發明所述的ATP生物發光試劑，包括熒光素酶、D-熒光素、去ATP無菌處理的發光穩定緩沖系統，所述的熒光素酶必須經過純化，純化的熒光素酶的活力本底比達到50~3000，其使得ATP生物發光試劑的發光比活力在0.4mL發光體系中，用1×10-7/L ATP測量時的相對發光對數值達到6.5~7.5，將熒光素酶、D-熒光素、去ATP無菌處理的發光穩定緩沖系統混合后冷凍得到凍干粉。本發明采用高靈敏度穩定發光的ATP生物發光試劑對飲用水衛生質量及GMP工廠表面衛生進行快速檢測，在半小時內可以完成取樣與快速檢測。
CN200610034385.9公開了一種利用ATP生物發光法進行微生物數量快速檢測的方法及檢測試劑盒，快速檢測試劑盒包括熒光素酶及其保護劑、D-熒光素、標準ATP、發光檢測緩沖液、非細胞ATP去除劑、微生物細胞ATP抽提劑等試劑。應用該檢測試劑盒進行微生物數量快速測定的標準方法是通過在選定的生物發光儀和選定的系統中做ATP標準曲線，取對數后得到線性回歸方程，將經過非目的ATP去除和微生物ATP抽提的樣品液，在同樣的儀器和系統中用同一批酶進行ATP生物發光檢測，同時做空白對照，得到樣品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的凈相對發光值取對數后，通過建立的回歸方程得到樣品的ATP濃度，根據細菌、酵母、霉菌和單細胞微藻等微生物的ATP含量可換算成細菌、酵母、霉菌孢子或單細胞微藻的細胞數，或只計相當于細菌數量。
[1] CN201110459845.3一種高純度D-熒光素的制備和純化方法
[2] CN201410013473.5一種檢測飲用水中衛生質量和GMP工廠表面衛生的ATP生物發光試劑、方法及試劑盒
[3] CN200610034385.9生物發光微生物數量抗干擾快速檢測試劑盒