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聚乙二醇化學修飾是將聚乙二醇高分子鏈化學偶聯到蛋白質分子上，通過增大藥物分子體積以有效延長其體內半衰期，同時遮蔽其免疫位點以顯著降低免疫原性，是國際上公認的最為有效的長效蛋白質制劑化技術之一。
怎樣把來自動物、植物和微生物的蛋白質
20世紀70年代,美國羅杰斯(Rutgers)大學的圖書館,經常可以見到生化教授FrankF.Davis的身影。那時還沒有計算機,他不得不在一排排書架中搜索。幸運的是已經有了復印機,他充分利用這一條件,復制了大量的文獻。當時,Davis教授正在準備申請美國國家科學基金會的基金,但卻需要找到一個創新的課題。他苦苦思考和調研的課題是怎樣把來自動物、植物和微生物的蛋白質做成適合于人體應用的藥物。當時并沒有DNA重組技術,動物、植物和微生物成了蛋白質藥物的主要來源,但是直接使用這些蛋白質卻產生了人體的免疫反應。Davis教授認為,解決這一難題的途徑是將一個親水的大分子連接到蛋白質分子上,利用親水性大分子的屏蔽作用,避免或減少外源蛋白質產生的免疫反應。
什么樣的大分子能夠滿足這一條件？Davis教授通過大量的文獻調研,把注意力聚焦在多糖類生物大分子上。一些多糖分子不僅水溶性好,而且生物親和性好,不易引起免疫反應。但是,多糖分子大都結構復雜,反應位點太多,很難做到反應產物的均一、可控,而且文獻上已經有前人進行了這方面的研究,再去研究并不具備新穎性和創新性,而且前人研究的結果也沒有解決根本的問題。
一天,他正在翻閱一本醫療期刊,忽然發現一篇將聚乙二醇和聚丙二醇嵌段共聚物溶液輸入人體血液的論文,其目的是在器官手術中避免脂肪栓塞。這篇論文很有意思,因為聚乙二醇和聚丙二醇在人們的印象中是化工產品,和藥物治療幾乎沒有什么關系。但現在醫生把它用于輸液,并且取得了初步的成功,說明這種化合物的生物安全性。于是，Davis教授立即把著眼點放在聚乙二醇這一親水性化合物上,開始進行新的調研。隨著調研的深入,他對聚乙二醇分子越來越感興趣。
其中n表示乙氧基單元的數量。PEG不僅溶解于水,而且還溶解于一部分有機溶劑,而當加入另一些有機溶劑時，又能從原來的溶液中沉淀出來。
和多糖不同,PEG只有末端的羥基可以活化并與蛋白質反應,可以避免反應的復雜性和產物復雜性。但PEG也有兩個羥基,如果和蛋白質反應,也可能形成不同交聯程度的“PEG–蛋白質–PEG–蛋白質”的偶聯物,甚至可以出現沉淀。是否可以找到一種只有一個末端羥基的聚乙二醇？Davis教授又進行了調研。他翻閱了大量的文獻,沒有結果;他又查找化工廠的產品目錄,終于使他眼睛一亮:在一個工廠的產品目錄上有單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
對這個羥基進行活化引入活化基團并與蛋白質反應,就只能在羥基末端形成PEG-蛋白質偶聯物,而不會形成交聯物。教授迅速和該廠家聯系,獲得了單甲氧基聚乙二醇。他從圖書館興沖沖地趕回實驗室,帶領他的學生開展了實驗研究。
20世紀70年代,是Davis教授課題組迅速崛起的時期。他們獲得了美國國家科學基金會(NSF)的資助。實驗取得了非常理想的結果,證明經過PEG修飾以后,牛血清白蛋白和牛肝過氧化氫酶在動物體內的免疫原性大大降低,而且延長了其在體內的半衰期。隨后,更多的蛋白質被他們用于PEG修飾,全都顯示了免疫原性下降、體內半衰期增加的結果。他們在國際期刊J.BiologicalChem.上連續發表的學術論文,引起了學術界的重視。
1977年,Davis教授申請了美國發明專利,內容為聚乙二醇或聚丙二醇修飾蛋白質和多肽,所用的聚乙二醇或聚丙二醇的分子量范圍為500~20000,修飾產物在注射到動物體內后沒有免疫原性。
1983年,Davis教授的博士畢業生Abuchowski找到了投資方,建立了國際上第一個把聚乙二醇修飾技術作為主營的生物技術公司Enzon公司。經過一段坎坷的產業化道路，Enzon公司已經成為國際著名的聚乙二醇修飾技術公司,已有十幾個藥物先后上市或處于臨床階段,總資產達到六億美元。
對蛋白質進行化學修飾的歷史已經很長了。從研究蛋白質結構開始,生物化學家就采用各種化學方法對蛋白質的氨基酸側鏈基團如巰基、氨基、咪唑基、胍基、吲哚基進行修飾,連接各種化學基團考察蛋白質結構和功能的變化。因此,當Davis教授PEG修飾蛋白質的研究內容發表后,并沒有在生物化學界引起多大的反響。而且當對酶進行修飾以后,測得的催化活性都下降,甚至很大。從這點出發,有人對PEG修飾持否定的態度。盡管修飾可以降低蛋白質的免疫原性,但生物活性的大幅度下降使得研究者常常放棄了進一步的探索。然而,當人們將修飾后的蛋白質輸入動物,測量其體內生物活性時,卻發現體內的生物活性出乎意外地高,而且持續很長時間。這個發現使生物技術公司振奮了,因為他們可以借助這項技術發展長效的基因工程蛋白質藥物。體外活性低,體內活性高,成為PEG修飾蛋白質的普遍現象,也是很多人之前沒有想到的。
通過進一步研究發現,體內活性的提升與PEG的分子量相關:分子量增加通常能夠增加體內的藥物半衰期(或半壽期),由此促進了聚乙二醇生產企業去合成更高分子量的mPEG,從1萬增加到2萬、3萬甚至4萬。分枝化的PEG也被合成出來,并表現出比相同分子量的直線型PEG更好的延長體內半衰期的作用。到目前為止,上市的聚乙二醇修飾蛋白質藥物都比原藥的半衰期提高幾倍以上,使用藥由原來的每天1針改為每周1針,極大地方便了患者,同時也提高了藥效。例如聚乙二醇修飾干擾素用于治療丙肝,其效果就優于未修飾的干擾素。因此聚乙二醇修飾從原來的克服免疫原性的初衷,已經發展為延長藥效、提高治療效果的主要手段。
PEG修飾藥物是否安全？經常有人問這樣的問題。雖然這項技術已經有30多年的歷史,藥物上市也已20多年,但像任何藥物一樣,從嚴謹、科學的角度出發都不能回答說“沒問題”。一種藥物的副作用,特別是隱匿的、長期使用的副作用,常常需要經過許多年后才知道。目前可以說的是,現在還沒有關于PEG修飾藥物出現重大事故的報道,但人們,特別是醫藥領域的專家們,都在關注、研究這些藥物可能出現的副作用。
聚乙二醇(PEG)作為醫用輔料有更長的歷史。早期美國FDA批準的人血丙種球蛋白凍干粉制劑中就有PEG作為配方之一。不過這里添加的PEG是雙端為羥基的聚乙二醇,也就是常規的PEG。關于常規的PEG,20世紀40年代就有人做過動物安全性試驗(Smythetal.,1947),并對其代謝進行了探討(Schafferetal.,1950)。試驗表明,分子量較小,例如只有幾百的PEG,有一定的腎毒性;當分子量大于1000以后,毒性不夠明顯，例如分子量1450、3350、6000的PEG對兔子靜脈注射給藥,總劑量高達10g/kg,沒有發現動物有毒性反應。關于代謝的試驗表明,腎排除是低分子量PEG從體內被清除的主要方式,隨著分子量增加,糞便排除亦是從體內清除的一種方式。
由于單甲氧基聚乙二醇(mPEG)和PEG極為相像,僅僅是末端一個羥基被替換,因此人們最初從早年PEG動物試驗數據推論mPEG也具有生物安全性。也有文章表明分子量4萬mPEG修飾的干擾素是通過肝臟代謝(Modietal.,2000)經糞便排出體外的。但是近年來已有研究發現,mPEG修飾的蛋白質藥物會引起機體產生對PEG的抗體,從而加速了藥物的清除。這種抗體的產生可能與其末端的單甲氧基有關(Armstrongetal.,2007;Shermanetal.,2012)。到目前為止,PEG抗體的發現還僅限于所報道的PEG修飾蛋白質藥物如尿酸氧化酶,在某種程度上影響了藥效,但是否會產生對人體的負面影響則需要進一步的研究。
關于其藥物副作用或潛在問題的研究,標志著PEG修飾藥物技術及其應用正在走向穩定和成熟。如今,幾乎所有的生物制藥公司都有人在研究PEG修飾技術:從PEG修飾延伸到其他修飾,如白蛋白修飾、脂肪酸修飾、多糖修飾等。