19132-06-0/(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇的制備

背景^[1][2]

2，3-丁二醇(2，3-butanediol，簡(jiǎn)稱2，3-BD)作為一種非常有潛力的C4化學(xué)品，可以廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料以及航空航天等各個(gè)領(lǐng)域。2，3-丁二醇是一種極具價(jià)值的液體燃料，還可用來(lái)制備聚合物、油墨、香水、防凍劑、熏香劑、增濕劑、炸藥以及藥物的手性載體等。2，3-丁二醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。

由于2，3-丁二醇結(jié)構(gòu)的特殊性，化學(xué)法生產(chǎn)2，3-丁二醇原料消耗大、工藝路線復(fù)雜、建設(shè)投資大、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重；而生物法制備2，3-丁二醇符合綠色化工和可持續(xù)性發(fā)展的要求，不過(guò)由于2，3-丁二醇的高沸點(diǎn)，高粘度、高親水性等特點(diǎn)，2，3-丁二醇分離純化難度較大，該過(guò)程一直是生物法制備2，3-丁二醇實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的下游關(guān)鍵技術(shù)。由國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀可知，目前報(bào)道的有關(guān)2，3-丁二醇的分離純化方法，2，3-丁二醇的分離效率和回收率都很低；工藝路線復(fù)雜，能耗高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

因此，開(kāi)發(fā)符合從特定發(fā)酵液中提取2，3-丁二醇特點(diǎn)的、高效、節(jié)能、環(huán)保的工業(yè)化分離工藝流程尤為重要。由于2，3-丁二醇沸點(diǎn)高，且發(fā)酵液中含有易結(jié)焦雜質(zhì)，直接采用蒸餾的辦法提純不僅能耗高、收率較低，而且純化困難；同時(shí)，2，3-丁二醇具有極強(qiáng)的親水性，與水精餾分離較為困難，因此需要加入能與水形成共沸物的溶劑精餾分離水；由此，發(fā)明人提出選用能與水形成低共沸物的萃取劑，從而可以在萃取后直接通過(guò)恒沸精餾分離水，降低后續(xù)精餾分離的能耗，簡(jiǎn)化分離流程。

針對(duì)2，3-丁二醇分離提取過(guò)程的特點(diǎn)，選用正丁醇作為萃取溶劑，從而可以通過(guò)共沸精餾在脫溶劑的同時(shí)從產(chǎn)品中脫除水，達(dá)到簡(jiǎn)化流程、降低后續(xù)精餾分離的能耗。對(duì)2，3-丁二醇-水-正丁醇三元液-液相平衡進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)：正丁醇作為萃取劑時(shí)，分配系數(shù)較大、相比要求和理論級(jí)數(shù)較小，但液-液不互溶區(qū)域和可操作范圍小。2，3 丁二醇包含3個(gè)異構(gòu)體(2R，3R) 2，3 丁二醇，(2S，3S) 2，3 丁二醇與meso 2，3 丁二醇。

結(jié)構(gòu)

合成路線^[3][1][2]

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的有關(guān)2，3-丁二醇的分離純化方法主要包括：(1)噴霧干燥法，即將高溫惰性氣體通入發(fā)酵罐，從而使可揮發(fā)性氣體氣化，由此分離2，3-丁二醇；(2)化學(xué)轉(zhuǎn)化法，采用甲醛或丁醛與發(fā)酵液中的2，3-丁二醇反應(yīng)，反應(yīng)生成物經(jīng)蒸餾、酸化處理回收2，3-丁二醇；(3)活性炭吸附法，包括活性炭吸附、丙酮或者二氧六環(huán)索氏萃?。?4)逆流汽提法，包括乙醇逆流汽提、過(guò)濾、精餾分離乙醇等過(guò)程；(5)溶劑萃取法，經(jīng)pH值調(diào)節(jié)、加熱、過(guò)濾、三效蒸發(fā)濃縮、正丁醇萃取、乙酸丁酯共沸精餾脫水、酯化、中和后得到2，3-丁二醇的二酯形式；(6)發(fā)酵-分離耦合法，包括滲透汽化、膜精餾、真空膜精餾、萃取等過(guò)程。

此外，國(guó)內(nèi)還有一些合成方法。

1. 一種分離提取2，3-丁二醇的方法，包含步驟為，

(1)首先，將發(fā)酵原液進(jìn)行絮凝、過(guò)濾、膜分離過(guò)程后得到2，3-丁二醇濾液，2，3-丁二醇濾液與正丁醇的質(zhì)量比為0.5∶1～1.5∶1，優(yōu)選為0.5∶1～1∶1，在混合槽攪拌，使混合完全；

(2)其次，將步驟(1)混合后得到的料液進(jìn)入澄清槽中靜置分層后，下層萃余液通過(guò)泵送回混合槽后繼續(xù)進(jìn)行萃取，上層萃取液進(jìn)入精餾塔；

(3)在精餾塔中萃取溶劑與水形成共沸精餾進(jìn)入塔頂，塔頂產(chǎn)物一部分回流重新進(jìn)入精餾塔，產(chǎn)物一部分采用蠕動(dòng)泵將送回到混合槽中，繼續(xù)對(duì)2，3-丁二醇水溶液進(jìn)行萃取；所述的正丁醇既為萃取溶劑，也是后續(xù)共沸精餾的脫水溶劑；萃取溶劑和精餾溶劑為正丁醇；

(4)經(jīng)過(guò)不斷萃取、精餾，2，3-丁二醇集中于塔釜；

(5)當(dāng)澄清槽水相中2，3-丁二醇質(zhì)量濃度為1.6％～1.8％時(shí)，停止萃取、精餾循環(huán)操作；

(6)最后，將塔釜液繼續(xù)精餾，得到2，3-丁二醇產(chǎn)品液，2，3-丁二醇單次萃取率可達(dá)74％以上。

2. 一種由葡萄糖制備(2S,3S)-2,3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法。具體步驟是：

步驟1：制備生物催化劑，即：終濃度為70～100克細(xì)胞干重/升的肺炎克雷伯氏菌CICC10011休止細(xì)胞

(1)斜面培養(yǎng)：將肺炎克雷伯氏菌CICC10011劃線到固體培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)10～18小時(shí)。

(2)種子培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，用無(wú)菌接種環(huán)挑取步驟(1)斜面上的一環(huán)菌泥，接種到50毫升液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10～14小時(shí)。

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，取步驟(2)所得培養(yǎng)液以體積比為5％的接種量接種到5升液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～20小時(shí)。

(4)收集菌體：將步驟(3)中得到的培養(yǎng)物8,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，并用pH7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體兩遍，然后將細(xì)胞重懸于pH7.0的磷酸緩沖液中，使細(xì)胞的終濃度為70～100克細(xì)胞干重/升，即為生物催化劑，備用。

其中，上述步驟(1)中所述固體培養(yǎng)基配方是：蛋白胨1.0克/升；牛肉膏1.0克/升；酵母粉0.5克/升；葡萄糖0.5克/升；乙酸鈉0.3克/升；檸檬酸三銨0.2克/升；Tween800.1克/升；K2HPO4·3H2O0.2克/升；CaCO30.5克/升；MgSO40.02克/升；MnSO40.05克/升；瓊脂1.5克/升，調(diào)pH為6.8～7.2，115℃滅菌20分鐘。上述步驟(2)～(3)中所述液體培養(yǎng)基配方是：葡萄糖80.0克/升；磷酸氫二銨6.0克/升；KCl1.8克/升；MgSO4·7H2O0.6克/升；EDTA0.51克/升；FeSO4·7H2O0.0225克/升；ZnSO4·7H2O0.0075克/升；MnSO4·7H2O0.0038克/升；檸檬酸0.21克/升；檸檬酸鈉0.294克/升，調(diào)pH至7.0，115℃滅菌20分鐘。

步驟2：利用步驟1制備的肺炎克雷伯氏菌CICC10011休止細(xì)胞生物催化劑制備(2S，3S) 2，3 丁二醇與meso 2，3 丁二醇的混合物。其中：以菌體濃度為14～56克細(xì)胞干重/升的生物催化劑即肺炎克雷伯氏菌CICC10011休止細(xì)胞，在37±2℃，pH5.0～9.0條件下轉(zhuǎn)化初始濃度為80～160克/升的葡萄糖，反應(yīng)3～10小時(shí)后，得到含(2S，3S) 2，3 丁二醇與meso 2，3 丁二醇混合物的轉(zhuǎn)化液；將所得轉(zhuǎn)化液以8,000±500轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘，去除所加入的生物催化劑，收集上清液進(jìn)行減壓蒸餾，待水份完全蒸干后，餾分即為(2S，3S) 2，3 丁二醇與meso 2，3 丁二醇的混合物；以氣相色譜可測(cè)定上清液中(2S，3S) 2，3 丁二醇與meso 2，3 丁二醇的濃度。

步驟3：再制備生物催化劑：終濃度為20～50克細(xì)胞干重/升的枯草芽孢桿菌ATCC23857休止細(xì)胞

(1)斜面培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌ATCC23857劃線到含有質(zhì)量體積比為1.5％瓊脂的固體培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)10～18小時(shí)。

(2)種子培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，用無(wú)菌接種環(huán)挑取步驟(1)斜面上的一環(huán)菌泥，接種到50毫升液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10～14小時(shí)。

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無(wú)菌的條件下，取步驟(2)所得培養(yǎng)液以體積比為5％的接種量接種到5升液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～20小時(shí)。

(4)收集菌體：將步驟(3)中得到的培養(yǎng)物8,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，并用pH7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體兩遍，然后將細(xì)胞重懸于pH7.0的磷酸緩沖液中，使細(xì)胞的終濃度為20～50克細(xì)胞干重/升，即為生物催化劑，備用。其中，上述步驟(1)中所述固體培養(yǎng)基配方是：蛋白胨10.0克/升；牛肉膏8.0克/升；酵母粉4.0克/升；葡萄糖20.0克/升；乙酸鈉5.0克/升；檸檬酸三銨2.0克/升；K2HPO4·3H2O2.0克/升；MgSO4·7H2O0.2克/升；MnSO40.2克/升；瓊脂15克/升，調(diào)pH至6.2，115℃滅菌20分鐘。上述步驟(2)～(3)中所述液體培養(yǎng)基配方是：葡萄糖70克/升；蛋白胨10克/升；酵母粉30克/升，調(diào)pH至7.0，115℃滅菌20分鐘。

步驟4：利用步驟(3)制備的枯草芽孢桿菌ATCC23857休止細(xì)胞生物催化劑拆分步驟(2)中制得的(2S，3S) 2，3 丁二醇與meso 2，3 丁二醇的混合物，同時(shí)制備(2S，3S) 2，3 丁二醇與(3S) 乙偶姻

3. 一種生產(chǎn)手性純(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，是將(2S，3S)-2，3-丁二醇脫氫酶基因在大腸桿菌中表達(dá)，并以此重組大腸桿菌全細(xì)胞為生物催化劑，以雙乙酰和葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)手性純(2S，3S)-2，3-丁二醇。本發(fā)明方法中參與菌株要求的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、成本低，并且生產(chǎn)過(guò)程及產(chǎn)物分離方便。生產(chǎn)的手性純(2S，3S)-2，3-丁二醇最高產(chǎn)量可達(dá)到26gL-1以上，ee值大于99%，具有推廣應(yīng)用價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

應(yīng)用^[4]

2，3 丁二醇各種異構(gòu)體包括(2S，3S) 2，3 丁二醇是不對(duì)稱合成中的重要原料，都是極具應(yīng)用潛力的醫(yī)藥中間體。手性二醇因具有兩個(gè)手性中心而成為一種非常重要的手性化合物,它可作為合成精細(xì)化學(xué)品、手性藥物、手性試劑等的手性砌塊。其中,(2S,3S)-2,3-丁二醇在不對(duì)稱合成含兩個(gè)鄰位手性中心的手性化合物中起重要作用。

主要參考資料

[1] CN200810202188.2一種分離提取2,3-丁二醇的方法

[2] CN201110247505.4一種由葡萄糖制備(2S,3S)-2,3-丁二醇與(3S)-乙偶姻的方法

[3] CN201110021066.5一種生產(chǎn)手性純(2S,3S)-2,3-丁二醇的方法

[4] 雙酮還原酶的基因挖掘、表征與重組菌發(fā)酵優(yōu)化研究