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(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇是一種光學純的2,3-丁二醇(2,3-bd)。2,3-丁二醇是一種重要的鄰二醇,具有3個立體異構體:meso-2,3-丁二醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇和(2S,3S)-2,3-丁二醇。作為一種重要的平臺化學物質,2,3-bd可用于生產有價值的衍生物,如甲基乙基酮和1,3-丁二烯。光學活性異構體可以作為防凍劑。光學純2,3-bd也可作為包含兩個鄰位立體中心的手性化合物的不對稱合成的良好構建塊。
步驟1、一種含有酮還原酶的溶液的制備方法,其包括以下步驟:
(1)將酮還原酶的編碼基因插入到pET28a(+)載體的Nco I和EcoR I酶切位點之間,得到重組載體;
(2)將上述重組載體轉化到大腸桿菌BL21中,得到重組菌株。
(3)將上述重組菌株接種至含有氯霉素的LB固體培養基中,并置于37℃條件下進行活化培養20h,得到菌落;用接種環挑取單菌落接種于含50mL的LB培養基(加有氯霉素)的250mL錐形瓶中,蓋上封瓶膜,用橡皮筋扎牢;然后,將錐形瓶放置于振蕩培養箱中,置于30℃、250rpm條件下培養過夜20h,得到培養液。
(4)取上述培養液接種于含有TB培養基(加有氯霉素)的錐形瓶中,蓋上封瓶膜,用橡皮筋扎牢,并將錐形瓶放置于振蕩培養箱中(30℃、250rpm)進行培養至OD600為0.7時,添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導劑誘導酮還原酶表達,并置于30℃、250rpm條件下繼續過夜培養16h,即可得到所述含有酮還原酶的溶液。其中,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的終濃度為1mmol/L。
步驟2、一種(2S,3S)-2,3-丁二醇的制備方法,其包括以下步驟:
(1)取6.06g上述步驟1得到的含有酮還原酶的溶液與20mL濃度為0.01mol/L的磷酸緩沖鹽溶液置于裝有磁子的干凈的250mL單口燒瓶中,并將單口燒瓶置于20℃的水浴中,以400rpm的速度對單口燒瓶內的溶液進行攪拌混合,得到混合液。
(2)在攪拌過程中,保持水浴溫度不變,并往上述混合液中依次添加0.202g的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、100mL的異丙醇以及20.2g的2,3-丁二酮進行密閉反應,得到反應液。
(3)對上述反應液進行減壓抽濾,得到淡黃色的濾液,然后將濾液置于45℃、0.08MPa的條件下進行旋轉蒸發處理,待幾乎無液體流出,得到提取液。
(4)將上述提取液置于50℃的水浴中,并用一根精餾柱和冷凝管無液體升溫至70℃進行精餾分離,即可得到(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇。
以重組E.coli全細胞為生物催化劑,以 雙乙酰(DA)和葡萄糖為底物轉化生產手性純2S,3S?BD的具體方法是:
(1)平板培養:將重組E.coli菌株劃線到含有質量體積比為1.5~1.8%瓊脂的并含有 100μgmL?1氨芐青霉素的LB平板上,37±1℃培養12±1小時;
(2)一級種子:在無菌的條件下,用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌落, 然后接種到5mL的含有100μg mL?1氨芐青霉素的LB液體培養基中,37±1℃搖床震 蕩培養12±1小時;
(3)二級種子:在無菌條件下,取步驟(2)所培養的菌液以體積比1~3%的接種量, 接種到30~500mL含有100μg mL?1氨芐青霉素的LB液體培養基中,37±1℃搖床震 蕩培養12±1小時;
(4)發酵罐培養:在無菌條件下,取步驟(3)所得的菌液以體積比為6~10%的接種 量接種到2~10L的含有100μg mL?1氨芐青霉素的LB液體培養基中,37±1℃培養5~ 20小時,然后再加入終濃度為1mM的IPTG,10~37℃誘導5~24小時,停止發酵;
其中,上述步驟(1)~(4)中所述的LB培養基配方為:1L蒸餾水中含:10g蛋白 胨,5g酵母粉,10gNaCl,121℃條件下滅菌15分鐘。
(5)收集菌體:將步驟(4)培養得到的培養物8,000±500rpm離心15分鐘;并用 0.85wt%的生理鹽水洗滌菌體2~3遍,然后將細胞懸起到pH 7、200mM的Tris?HCl緩 沖液中,使細胞的終濃度為2~10g L?1;將菌體置于4℃的冰箱中保藏,即得到重組E.coli 全細胞生物催化劑,待用;
(6)轉化實驗制備產物:以濃度為2~10g L?1的生物催化劑,在10~42℃、pH 5.0~9.0 條件下,180rpm搖床震蕩,轉化初始濃度為5~20g L?1的DA,并加入5~120g L?1的葡 萄糖以補充反應所需輔因子的消耗;每隔2小時取樣,樣品以8,000±500rpm離心10~15 分鐘,去除所加入的生物催化劑,檢測上清中DA和葡萄糖濃度,根據DA和葡萄糖濃度 補加DA和葡萄糖,使DA濃度達到5~20g L?1,葡萄糖濃度達到5~120g L?1;對上清進 行氣相色譜分析測定轉化液中2S,3S?BD的濃度及光學純度;當2S,3S?BD的濃度不再增加 時,停止轉化。
[1] [中國發明] CN202010556922.6 一種(2S,3S)-2,3-丁二醇的制備方法
[2] [中國發明,中國發明授權] CN201110021066.5 一種生產手性純(2S,3S)-2,3-丁二醇的方法