14277-97-5 / 軟骨藻酸的作用

背景及概述^[1]

軟骨藻酸(domoicacid，DA)主要是由海洋中的某些擬菱形藻屬(Pseudo-nitzschia)和菱形藻屬?(Nitzschia)的硅藻產(chǎn)生的一種藻毒素，前者為主要產(chǎn)毒藻種，進一步研究發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生軟骨藻酸的擬菱形藻主要有尖刺擬菱形藻多列型(P.pungensf.multiserie)、偽優(yōu)美擬菱形藻(P.pseudodelicatissima)、成列擬菱形藻(P.seriata)和澳洲擬菱形藻(P.australis)等。

軟骨藻酸化學(xué)結(jié)構(gòu)與谷氨酸和紅藻氨酸相似，具有興奮性毒性，誤食過量的軟骨藻酸中毒后會導(dǎo)致記憶缺失。最早報道的人類軟骨藻酸中毒事件發(fā)生在1987年加拿大愛德華王子島，因食用受軟骨藻酸污染的貽貝導(dǎo)致100多人中毒，臨床表現(xiàn)為胃腸道癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，并且有4人死亡。目前研究結(jié)果顯示，有相當一部分濾食性海洋生物能夠在其體內(nèi)累積軟骨藻酸，其中包括雙殼貝類、魚類(如鳀魚和鯖魚)和甲殼類(如螃蟹)等，并且對軟骨藻酸有較強的耐受力，再經(jīng)食物鏈傳遞會對所在地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成影響，對水生動物及人類健康造成極大危害。

最新研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄牙沿海9月下旬到11月的非擬菱形藻生長期，在章魚的食物(貝類)中未檢測到軟骨藻酸，而章魚的消化腺中卻檢測到了軟骨藻酸，這很可能是由于章魚長期富集軟骨藻酸所致，可見軟骨藻酸能通過貝類等的富集進入海洋生物的食物鏈中。此外，食物鏈中一些高級的海洋生物(如鯨魚、海獅和海鳥等)均有軟骨藻酸中毒的報道。

目前對軟骨藻酸致興奮性神經(jīng)毒作用機制的研究并不多見，根據(jù)相關(guān)文獻報道興奮性神經(jīng)毒性是促進神經(jīng)元退行性病變的重要機制之一，因此對軟骨藻酸致神經(jīng)毒作用機制研究可能為癲癇，老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的思路。

化學(xué)特性^[2]

軟骨藻酸(分子式C15H21NO6，分子量311.3)是由水中藻類產(chǎn)生的一種生物毒素，結(jié)構(gòu)與紅藻氨酸和谷氨酸相似，是紅藻氨酸受體的興奮劑。目前發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生該毒素的硅藻類有Pseudonitzschiaaustralis，P.pungensf.multiseries，P.pseudodelicatissima等。檢測水中P.australis的含量及軟骨藻酸的濃度，當該藻類在水中的含量僅為4.0×103/L時，即可檢出軟骨藻酸。

生物富集作用^[2]

水中的蛤蜊、蚌類及魚均可富集水中藻類產(chǎn)生的軟骨藻酸，并對軟骨藻酸有較強的耐受力。軟骨藻酸經(jīng)食物鏈富集后，會對所在地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成影響，并引起動物發(fā)病和死亡。1996年加利福尼亞半島發(fā)生褐色鵜鶘大量死亡事件。調(diào)查研究表明，海鳥的死亡與食用受硅藻污染的鯖魚有關(guān)，而這些硅藻可產(chǎn)生軟骨藻酸。為防止含該毒素的產(chǎn)品進入市場，對當?shù)毓揞^工廠進行產(chǎn)品安全檢查，并采取有效檢測措施，防止了軟骨藻酸的擴散和同類事件的發(fā)生。

1991年秋，美國加利福尼亞州蒙特利灣和奧爾良沿海海鳥大量死亡，也是一起軟骨藻酸中毒事件，并分離出了能產(chǎn)生軟骨藻酸的藻類。研究軟骨藻酸在水生植物及動物體內(nèi)的分布，對制定衛(wèi)生標準及防止中毒事故發(fā)生具有重要意義。于1991～1993年對不同季節(jié)的蛤蜊及蛤蜊的不同部位進行軟骨藻酸含量測定，發(fā)現(xiàn)其可食用部分軟骨藻酸含量12月份最高，平均可達106mg/kg，此后逐漸下降。但在濃度達到高峰后16個月，蛤蜊體內(nèi)的軟骨藻酸仍不能完全消失。此外，蛤蜊的各個部位均能檢出軟骨藻酸，其中足部濃度最高，可達223mg/kg；虹吸管部位的濃度最低。

結(jié)果表明如果軟骨藻酸在鄧杰內(nèi)斯蟹的肝胰腺中的污染濃度不超過30mg/kg，在蛤中不超過20mg/kg時，在相關(guān)人群及消費蟹類和蛤類較少的人群中，未見到與軟骨藻酸毒性有關(guān)的健康影響。軟骨藻酸經(jīng)食物鏈富集后，也可引起海洋哺乳動物中毒死亡。1998年5月和6月，沿中加利福尼亞海岸有400多頭海獅死亡；許多海獅出現(xiàn)神經(jīng)功能紊亂癥狀。同時在該地區(qū)海灣發(fā)現(xiàn)了假菱形藻屬(硅藻)赤潮。

此種赤潮中的藻類可產(chǎn)生軟骨藻酸。在食浮游生物的魚(包括北部鳳尾魚和沙丁魚)和海獅的組織和尿液中均檢出軟骨藻酸。鳳尾魚內(nèi)臟軟骨藻酸濃度高達233±5μg/g。海獅以這些魚類為食。海獅糞便中軟骨藻酸濃度為125～136μg/g。對這些同時發(fā)生事件的觀察結(jié)果表明，軟骨藻酸經(jīng)食物鏈富集，最終導(dǎo)致海洋哺乳動物死亡。在軟骨藻酸產(chǎn)生高峰期采集的藍蚌幾乎不含或僅含微量的軟骨藻酸。

因此僅對蚌類的毒性進行監(jiān)測無法有效地對進入食物鏈中足以影響海洋生物甚至人類健康的軟骨藻酸的危害作出判定。至今普遍認為水中的軟骨藻酸由藻類產(chǎn)生，經(jīng)食物鏈和其它方式被水生動物(尤其是貝類)不斷濃集，毒素濃度可達相當高的水平，而人或動物食用被污染的水產(chǎn)品即可引起食物中毒。軟骨藻酸污染不僅危害人類健康，同時給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。

人類健康的影響^[2]

軟骨藻酸具有神經(jīng)興奮作用和神經(jīng)毒性作用，可引起記憶損害，還能導(dǎo)致中毒的人和動物死亡。1987～1988年加拿大發(fā)生一起以胃腸道癥狀及罕見的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主要表現(xiàn)的食物中毒暴發(fā)流行，250多人發(fā)病，中毒癥狀包括嘔吐(76%)、腹部痙攣(52%)、腹瀉(42%)、頭痛(43%)，部分病人出現(xiàn)癲癇發(fā)作、昏迷及短時間記憶喪失(25%)、血壓不穩(wěn)，3例病人死亡。調(diào)查結(jié)果表明，這起嚴重中毒暴發(fā)流行是由于食用含有軟骨藻酸毒素的蛤類引起的，為首次報道的由軟骨藻酸引起的食物中毒。

對一位軟骨藻酸食物中毒的男性患者的研究發(fā)現(xiàn)，中毒癥狀包括惡心、嘔吐、意識模糊、昏迷，3周后癥狀改善，但仍有經(jīng)常性的癲癇發(fā)作并伴有記憶缺失。腦電圖初期表現(xiàn)為周期性癲癇樣放電，中毒一年后發(fā)展為復(fù)雜的不完全癲癇發(fā)作，腦電圖表現(xiàn)為雙側(cè)顳葉分別出現(xiàn)癲癇樣放電，核磁共振造影顯示海馬萎縮，尸檢發(fā)現(xiàn)雙側(cè)海馬硬化。在另外4名中毒患者的海馬和杏仁核中亦發(fā)現(xiàn)了類似的病理變化，并出現(xiàn)相同的神經(jīng)損害癥狀。

毒性作用及機制^[2]

1.軟骨藻酸中毒時除表現(xiàn)出胃腸道癥狀外，還出現(xiàn)嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，包括記憶喪失、昏迷等。因此，自1987年加拿大首次在蛤類中檢出軟骨藻酸以來，對該毒素的毒性作用機制、生態(tài)分布、檢測技術(shù)等的研究受到廣泛重視，近年來有關(guān)報道越來越多。軟骨藻酸可引起人和動物較嚴重的中樞神經(jīng)損害。動物實驗表明，軟骨藻酸對與內(nèi)臟功能有關(guān)的腦干區(qū)域具有興奮作用，而對與記憶有關(guān)的腦區(qū)域具有明顯的神經(jīng)毒性作用。大鼠腹腔注射軟骨藻酸的LD50為3600μg/kg。大鼠腦室內(nèi)染毒(0.03～3nmol)時，低劑量組出現(xiàn)顫抖、運動過強、面部陣攣，高劑量組出現(xiàn)癲癇征候群。

2.軟骨藻酸對脊髓的損害也受到重視。給出生后7d的大鼠皮下注射軟骨藻酸，劑量分別為0.10、0.17、0.25、0.33、0.42和0.50mg/kg，各個劑量組均出現(xiàn)軟骨藻酸引起的抓撓、尾部輕彈及游泳樣運動等癥狀。高劑量組進一步出現(xiàn)后肢麻痹、前肢顫動，2小時內(nèi)出現(xiàn)死亡。在0.33mg/kg劑量組出現(xiàn)死亡和麻痹的百分率分別為47%和65%。記錄該劑量組的動物皮層腦電圖和同步干擾電活動，未見腦損傷。應(yīng)用微分析技術(shù)檢測軟骨藻酸對紋狀體多巴胺活性的影響，結(jié)果表明腦內(nèi)給予不同劑量的軟骨藻酸可使大鼠紋狀體細胞外多巴胺水平增加及細胞外多巴胺代謝產(chǎn)物降低。

神經(jīng)毒理學(xué)研究表明，鈣離子作為細胞內(nèi)信使，參與幾乎一切外來信號調(diào)控細胞功能的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，也是參與細胞內(nèi)代謝活動的重要元素，因此細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持對于生命活動是至關(guān)重要的，在神經(jīng)細胞的損傷中具有特殊作用。這些研究結(jié)果表明在培養(yǎng)的新生海馬錐體細胞中至少有兩種對軟骨藻酸敏感的非N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型，軟骨藻酸引起的鈣進入機制是經(jīng)電壓依賴型鈣通道實現(xiàn)的。

制備^[3]

一種利用海洋硅藻共棲細菌發(fā)酵制備遺忘性貝毒軟骨藻酸的方法，包括以下步驟：

1)菌株活化：將斜面菌種接種到搖瓶種子液培養(yǎng)基中，在30-32℃下培養(yǎng)12-15h，得到活化菌株種子液；

2)種子液準備：向種子培養(yǎng)液中通入蒸汽加熱，121-123℃滅菌25-35min，冷卻至30-31℃，采用火種接種法將活化菌株種子液接種到種子培養(yǎng)液中，通氣攪拌，通氣量為40-50L/min，攪拌速率為160-180r/min，30-33℃下恒溫培養(yǎng)15-18h，得到種子液；

3)發(fā)酵：向發(fā)酵液中通入蒸汽加熱，121-123℃滅菌25-35min，冷卻至30-31℃，將步驟2)得到的種子液接種到發(fā)酵液中，通氣攪拌，通氣量為40-60L/min，攪拌轉(zhuǎn)速140-160r/min，30-33℃下恒溫培養(yǎng)48-52h，得到遺忘性貝毒軟骨藻酸發(fā)酵液；

4)提取：將遺忘性貝毒軟骨藻酸發(fā)酵液進行板框過濾得到菌體，加入甲醇溶液，靜置10-20min，過濾，得到一次提取液和過濾菌體；將過濾菌體加入甲醇溶液中，靜置10-20min，過濾，得到二次提取液和過濾菌體；將過濾菌體加入甲醇溶液中，靜置10-20min，過濾，得到三次提取液，將一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸濃縮，得到遺忘性貝毒軟骨藻酸粗提物；

5)純化：將遺忘性貝毒軟骨藻酸粗提物進行洗脫，收集遺忘性貝毒軟骨藻酸組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑，得到白色粉末，即為遺忘性貝毒軟骨藻酸。

主要參考資料

[1] 軟骨藻酸神經(jīng)毒性作用機制研究進展

[2] 水生態(tài)環(huán)境中神經(jīng)毒性生物毒素——軟骨藻酸

[3] CN201811168447.4一種利用海洋硅藻共棲細菌發(fā)酵制備遺忘性貝毒軟骨藻酸的方法