136112-00-0/苯酚-氯仿-異戊醇混合物的制備方法

背景及概述^[1]

苯酚-氯仿-異戊醇混合物常用作分析提取液用于提取DNA、多糖等。

制備^[1-4]

苯酚-氯仿-異戊醇混合物應用舉例如下：

1）用于一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取，向產糖被細菌的培養物中加入提取緩沖液和溶菌酶，37℃下靜置10min，再加入蛋白酶K，65℃下靜置1h；加入苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提；加入氯仿-異戊醇混合溶液，抽提；加入冷乙醇和醋酸鈉，離心，沉淀經乙醇洗滌后室溫干燥，加DNA提取緩沖液溶解；加入RNA酶，37℃下靜置10min；加入PEG6000，混勻，50℃下靜置10min；加入苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提；加入氯仿-異戊醇混合溶液，抽提；加入冷乙醇和醋酸鈉溶液，離心，沉淀經乙醇洗滌后室溫干燥，加ddH2O或者TE緩沖液溶解，即為提取到的DNA溶液。

2）一種從沙冬青提取高質量基因組DNA的方法，包括如下步驟：(1)植物材料液氮速凍研磨成粉；(2)加DNA提取液并加蛋白酶K至20μg/mL，65℃保溫；(3)離心收集上清液，加等體積的苯酚：氯仿：異戊醇混合液抽提，再離心收集上清液；(4)加0.6~0.8倍體積異丙醇沉淀DNA；乙醇洗滌，部分干燥后溶于TE緩沖液，得DNA粗提液；(5)向DNA粗提液中加入NaCl至0.5mol/L，再加入CTAB/NaCl溶液，并加入RNase-A至終濃度10μg/mL，65℃保溫；(6)依次用等體積苯酚：氯仿：異戊醇混合液和等體積氯仿：異戊醇混合液抽提，收集上清液；(7)加0.6~0.8倍體積異丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗滌，部分干燥后溶于TE緩沖液，得到高質量的DNA提取液。本發明可以從沙冬青提取高質量的基因組DNA。

3）一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法，它包括如下操作步驟：取環境樣品，加入水或緩沖液，混勻；加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；將移取的上層進行離心，棄上清，保留沉淀；將沉淀洗滌至基本無色，重懸菌液即可。本發明方法簡化了PCR檢測的前處理步驟，省去了繁瑣的DNA提取步驟，消除了PCR反應的干擾物質，直接用本方法處理得到的稀釋菌液或菌落為模板進行PCR擴增，靈敏高，特異性好，檢測時間短，大大降低了檢測成本。

4）一種馬齒莧多糖的提取方法。所述方法包括以下步驟：(1)馬齒莧原藥材粉碎后，采用乙醇或石油醚進行回流提取兩次，每次2h，抽濾，烘干得到馬齒莧藥材粉末備用。(2)馬齒莧藥材粉末置于高壓滅菌鍋中進行提取，設定溫度范圍105-121℃，提取時間1h。(3)提取出的粗多糖溶液，采用等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)進行萃取去除蛋白質，留取上清水相溶液，將溶液進行旋蒸，采用無水乙醇沉淀過夜，離心分離獲得多糖。采用本發明方法提取的多糖產量比傳統水浴法提取的多糖量高出89％-96％，同時本發明方法所采用的設備簡單易獲取，純化多糖的方法簡單重復性好，整個過程提取成本低廉，適合大規模工業生產使用。

主要參考資料

[1]CN201210145537.8一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法

[2]CN201510875261.2一種從沙冬青提取基因組DNA的方法

[3]CN201611152634.4一種從環境樣品中提取純化總細菌的方法

[4]CN201810700186.X一種馬齒莧多糖的提取方法