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10-甲酰葉酸是一種葉酸衍生物。葉酸是一種具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水溶性B族維生素，是指四氫葉酸及其衍生物這一類物質(zhì)，它由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷酰基鏈組成。作為一碳供體，葉酸參與嘌呤、嘧啶的合成和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化。人體缺少葉酸會(huì)導(dǎo)致一系列的慢性疾病，例如神經(jīng)管缺陷、先天缺陷、巨紅血球性貧血、心血管疾病和癌癥等。
CN201510527402.1報(bào)道了一種快速高靈敏同步定量檢測(cè)蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步驟：
1)、提取植物葉片中的葉酸及葉酸衍生物：
利用0.05M磷酸緩沖液煮沸提取植物葉片的葉酸，冷卻并離心后，得上清液，上清液為葉酸提取物(包括葉酸及葉酸衍生物)；
2)、添加兩種葉酸軛合酶
往步驟1)中的葉酸提取物添加老鼠血清軛合酶和雞胰腺軛合酶，加入氬氣后37℃孵育2小時(shí)，100℃水浴5分鐘終止酶活，離心后取上清液，上清液為葉酸去軛合提取物；
3)、使用超濾離心管純化植物葉片葉酸去軛合提取物
使用10kDa500μL超濾離心管(Millipore，美國(guó))，活化后，往里加入500μL步驟2)得的葉酸去軛合提取物，12000g4℃離心15分鐘，得到純化后的葉酸純化液(為過(guò)柱后所得的溶液)；
4)、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分離葉酸衍生物質(zhì)譜方法
超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng)為四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(WatersXevoTQ-S,Waters,美國(guó))常壓電噴霧電離(ESI)正極模式。WatersIntelliStartTechnology通過(guò)自動(dòng)和手動(dòng)優(yōu)化所有葉酸衍生物的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiplereactionmonitoring,MRM)。每一種葉酸衍生物使用兩個(gè)或三個(gè)子離子確定，結(jié)果如表1。MassLynx4.1(Waters,美國(guó))軟件用于系統(tǒng)運(yùn)行、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。表1葉酸及葉酸衍生物的多離子反應(yīng)檢測(cè)和化合物指標(biāo)
5)、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分離葉酸衍生物色譜方法
使用WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)(Waters，美國(guó))進(jìn)行葉酸衍生物的色譜分離，運(yùn)行軟件為TargetLynx4.1(Waters，美國(guó))。柱溫箱維持40℃，自動(dòng)進(jìn)樣器維持4℃。色譜柱是ACQUITYUPLCBEH,C18column，規(guī)格為2.1mm×50mm，粒徑1.7μm(Waters，美國(guó))連接一個(gè)VanGuard前置柱C18，規(guī)格為5mm×2.1mm，粒徑1.8μm(Waters，美國(guó))。流速0.4mL/min；進(jìn)樣量2μL，運(yùn)行時(shí)間5分鐘。流動(dòng)相為洗脫液A(0.1％甲酸溶于水)和洗脫液B(0.1％甲酸溶于乙腈)梯度洗脫，詳見(jiàn)表2。針頭清洗溶劑為乙腈/水混合液(50/50,v/v)；表2UPLC-MS/MS最佳梯度洗脫
6)、植物葉片葉酸衍生物的定量測(cè)定。
作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量檢測(cè)植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的改進(jìn)：步驟1)中的0.05M磷酸緩沖液濃度為每升加入10gL(+)-抗壞血酸和10ml二巰基丙醇的磷酸緩沖液。
作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量測(cè)量植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟2)中在每10mL葉酸提取物中加入2mL雞胰腺軛合酶，搖勻后，吸取3mL溶液于50mL離心管中，加入100μL老鼠血清軛合酶，搖勻，充入氬氣，37℃孵育2小時(shí)，100℃水浴5分鐘終止酶活。
作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量檢測(cè)植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟6)為：根據(jù)步驟4)和步驟5)的條件，對(duì)植物葉片葉酸及其衍生物進(jìn)行定量測(cè)定，記錄主峰峰面積，按照外標(biāo)法以峰面積自動(dòng)計(jì)算得出四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的含量，再根據(jù)四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算總?cè)~酸含量。
[1][中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)]CN201510527402.1快速高靈敏同步定量檢測(cè)葉片總?cè)~酸及葉酸衍生物的方法