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由于具有簡單的比色讀數，基于過氧化物酶的檢測方法備受關注，例如辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗體用于免疫組織化學和ELISA、納米酶和DNA酶。自從3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）首次在基于HRP的免疫分析中應用以來，TMB是迄今為止最常用的生色底物，其顯色反應基于H2O2存在下HRP催化氧化TMB。在TMB出現之后，逐漸取代了其他聯苯胺衍生物在比色測定中的使用。在研究和評估納米酶的過氧化物酶和氧化酶樣活性的過程中，TMB在大多數情況下被用作標準底物。取代其他聯苯胺衍生物的一個重要原因是它們的高致癌性。聯苯胺衍生物的發色敏感性是分析化學最重要的參數之一，但從化學角度明確闡述TMB的變色原理優于其他聯苯胺底物具有重要意義。
近期，四川大學吳鵬教授課題組報道了聯苯胺類底物的化學性質與顯色反應的分析性能之間的關聯。該體系選擇了九種具有不同特性（不同取代基和不同取代數）的聯苯胺衍生物，并用四個典型的TMB生色系統（HRP，納米酶，DNAzyme，光敏氧化方案）進行了研究。在現有聯苯胺底物用于過氧化物酶的測定中，TMB表現出最高的靈敏度，更好的有色產物色純度和合理的氧化產物穩定性。與TMB以外的兩種四取代的聯苯胺衍生物進行比較，TMB的性能（靈敏度，色純度和有色產物的穩定性）具有很大優勢，在比色測定中證實了其“選定底物”的狀態。相關成果以“The Rationale of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) as the Chromogenic Substrate in Colorimetric Analysis”為題發表在國際分析化學權威雜志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02149）。
圖一、聯苯胺類似物與四個顯色反應系統之間定量比較的示意圖
首先，作者研究了對不同聯苯胺底物的選擇。TMB氧化的顯色反應基于以下核心部分：聯苯胺，其包含兩個易于氧化的氨基，可以通過單電子和兩電子途徑被氧化為有色產物。取代基的給電子和吸電子性質會影響氨基上的電子云密度，因此可能影響聯苯胺衍生物的氧化反應性。從平均局部電離能圖可以看出，聯苯胺上氨基的電子云密度低于3,3'-二羥基聯苯胺但高于3,3'-二氯聯苯胺，表明這三種衍生物的反應活性可能不同。另外，作者確定了九種聯苯胺底物的光譜特征，其中聯苯胺在近紫外線范圍內表現出典型的吸收帶。
圖二、聯苯胺衍生物的顯色反應，結構以及部分底物的ALIE圖。
接著，作者研究了聯苯胺底物的氧化特性。由于聯苯胺的氧化過程分兩個步驟進行，以TMB為例，371 nm和652 nm帶是由二胺（TMB）作為供體和二亞胺基離子（TMB2+）作為受體組成的電荷轉移絡合物。根據兩個吸收峰之間的差異，可以將7種底物（2Cl除外）分為三類：差異組（4CH3和2CH3），部分重疊的組（2H和2OCH3）和一個重疊的組（2NH2和2OH）。通常，甲基取代的聯苯胺衍生物比其他的具有更好的差異吸收峰。4CH3（TMB）和2CH3的色純度通常優于其余衍生物，并且TMB的半高全寬也小于靜止的基板，這些結果證明了TMB（4CH3）的光譜和色純度可以在吸收測量和肉眼讀數方面實現更好的量化。為了研究七種聯苯胺底物的敏感性，作者使用四個生色系統對其進行測試。圖三中總結了七個生色系統中七個聯苯胺類似物的相對靈敏度。通常，CH3-和OCH3-取代的聯苯胺衍生物的敏感性高于其他衍生物。無論發色系統如何，4CH3（TMB）都表現出最高的靈敏度，證實了其在比色測定中的“選定底物”狀態。酶動力學參數的測量也表明4CH3（TMB）在顯色系統中通常表現出較高的Vmax和較低的Km。
圖三、聯苯胺衍生物的氧化特性和敏感性研究表征圖。
最后，作者研究了氧化產物的穩定性。有色物質的穩定性對于比色測定中的定量非常重要。作者通過“C點和LED”光敏系統探索了用于收集被氧化底物的吸光度變化。聯苯胺底物的顏色讀數與氧化產物穩定性之間的區別已通過其氧化還原電勢進行了驗證。從4CH3（TMB）獲得了分別對應于單電子和雙電子氧化的兩對氧化還原峰，良好分離的峰表明兩個氧化步驟可以逐步進行而基本不重疊。從1 h后單電子氧化產物的吸收光譜變化中證實了它還保證了單個氧化產物的穩定性。對于2OCH3，由于單電子和兩電子氧化產物的混合物共存，兩個氧化峰之間存在明顯的重疊，另外這種氧化產物不穩定，并在短時間內自發地轉變為兩電子對應物，使吸光度測量成為問題。對于2NH2，氧化還原峰很難區分，并且在一步中就被氧化成兩電子產物，但是相對較低的氧化電位（0.13 V）使2NH2易于在空氣中發生自氧化。在7種底物中，4CH3（TMB）的電勢差最大，因此難以形成混合氧化產物，并且TMB的兩電子氧化產物可保持穩定至少1 h。該研究證實了TMB在單電子氧化或兩電子氧化過程中，對于UV-vis定量和肉眼讀數均具有合理的穩定性。
圖四、聯苯胺衍生物的氧化產物的穩定性研究表征圖。
另外，2OCH32CH3的單電子和兩電子氧化產物的光譜類似于2CH3和4CH3（TMB）的光譜；4OCH3的單電子和兩電子氧化產物的光譜出現重疊。RGB值所揭示了這些四取代底物的氧化產物的色純度通常也優于聯苯胺和二取代衍生物。另外，2OCH32CH3的單電子氧化產物的穩定性較差，這可能是因為氧化還原峰的電位差較小；4OCH3的單電子氧化產物的穩定性甚至更低，而兩個氧化還原峰幾乎沒有任何特征。對于雙電子氧化產物和原始化合物的穩定性，4CH3（TMB）的性能仍優于2OCH32CH3和4OCH3。因此，在低致癌性四取代底物中，TMB仍然具有最高的靈敏度，色純度和合理的穩定性。
圖五、四取代-聯苯胺衍生物的氧化產物的穩定性研究表征圖。
小結：四川大學吳鵬教授課題組從發色反應和分子特性探討了TMB作為比色測定中選定底物的基本原理。通過發色系統的研究，證明TMB表現出優于其他聯苯胺衍生物的最佳靈敏度。單電子氧化產物和兩電子氧化產物之間明顯的電勢差使其成為定量分析的最佳選擇。TMB作為顯示底物不僅與其低毒性有關，還與其分析性能以及分子特性有關。另外，甲基取代的聯苯胺（2CH3、4CH3和2OCH32CH3）的性能通常優于其他類似物。四取代的衍生物大多優于二取代的衍生物。