9032-75-1 / 果膠酶分離純化的方法有哪些？

【背景及概述】^[1][2][3]

隨著分析手段的不斷提高，人們進一步了解到果膠的分子結構并開發出相應酶類，從而使果膠酶的應用進入一個新的蓬勃發展時期，其應用已不再停留在最初的飲料加工上，而是在糧油加工、紡織、造紙、化妝品等行業都有所發展，在與天然產物提取相關的精細化工、醫藥等領域也有了階段性的進展，果膠酶的固定化研究也正在逐步深入。能分解果膠質的酶被稱為果膠酶。目前，國內外在果膠酶方面的研究正在廣泛深入地進行。果膠酶工業應用的商業利潤促進了對其研究及開發，全界有很多廠商生產果膠酶制劑，并且隨著技術的進步，令生產成本下降，應用的范圍也越來越廣。果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生動物和昆蟲中也有發現。在微生物中，細菌、放線菌、酵母和霉菌都能代謝合成果膠酶。果膠酶一般分為原果膠酶、果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酷酶等。目前果膠酶在食品、紡織、醫藥、造紙、環境、生物技術、飼料等領域得到廣泛應用。

【分布】^[1]

果膠酶是指能夠分解果膠物質的多種酶的總稱，果膠分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以糖苷鍵聚合而成的多糖鏈!常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側鏈，游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子、特別是與硼化合物結合在一起。果膠結簡圖如下：

許多霉菌及少量的細菌和酵母菌都可產生果膠酶，主要以曲霉和桿菌為主。 新近報道的其它菌有青霉如意大利青霉、擴展青霉以及Penicilliumgriseoroseum等，白絹菌、立枯絲核菌、微小毛霉、高大毛霉、熱解糖梭菌、匐枝根霉、出芽短梗霉、粗糙鏈孢霉嗜熱側孢霉等。由于真菌中的黑曲霉屬于公認安全級，其代謝產物是安全的，因此目前市售的食品級果膠酶主要來源于黑曲霉，最適pH 值一般在酸性范圍。近年來，一些來源于細菌桿菌屬的堿性果膠酶日益受到重。隨著分子生物學技術的不斷提高，也可利用基因克隆技術實現膠酶在其它微生物宿主的表達。

【分類】^[1]

果膠酶大致分為果膠水解酶、果膠裂解酶、果膠酯酶和原果膠酶等，其中果膠水解酶又可分為聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶等，由于人們對PG 的認識最早、應用最廣泛，因此早先常被稱為果膠酶。為避免發生概念混淆，國際上常用Pecto lytic Enzyme 來代替Pectinase。

【分離純化】^[2]

果膠酶分離純化的方法有很多種，可根據具體情況選擇應用。

1.粗酶液的制備

粗酶液的制備通常來自：1）無細胞的微生物培養基上清液；2）含有果膠酶的植物組織浸出物；3）微生物感染植物后該植物組織浸出物。第一種方法來源于微生物的酶，如果是細胞外酶，粗酶液制備比較簡單，即通過過濾或離心去除菌體即可。如果是細胞內酶，則需要利用超聲波法、酶解法、堿、去垢劑法以及研磨法等破碎細胞，使酶釋放出來。對于第二、第三種方法從植物組織提取酶，需要對植物組織進行勻漿。提取過程保持低溫對酶的穩定有益處。此外鹽濃度、緩沖液成分以及pH都對提取的收率有影響。用磷酸鈉溶液成功提取了來自西紅柿的內切果膠酸鹽裂解酶，并用含氯化鈉的乙酸緩沖液提取了地錢植物組織中外切聚半乳糖醛酸酶。

2.硫酸銨鹽析

制得的粗酶液，通常需要進行硫酸銨鹽析沉淀。一般采用60 %～ 90 %飽和度的硫酸銨分離來自B。Subti lis的果膠裂解酶在F.pectinororum 果膠裂解酶粗酶液加55 %～85 %硫酸銨飽和度可以使99 %的裂解酶分離出來而比活性大大提高。從馬鈴薯病原體Fusarium roseum 中60 %～80 %硫酸銨沉淀組分經透析得到大部分裂解酶，進一步提純可使比活性提高117 倍。用硫酸銨將來自Phomamedicaginisvar pinodella 的果膠裂解酶純化了6倍。采用85 %飽和度的硫酸銨鹽析法將來自Cort icium rol f si i 的聚半乳糖醛酸酶純化了8 倍，酶收率52 %。用硫酸銨鹽析法從Aspergi llus japonicus 中提取了果膠裂解酶，酶收率達87 %。

3.有機溶劑沉淀

另一種用于初步提純、濃縮果膠酶的方法是有機溶劑沉淀法，通常使用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙醇和丙酮。同硫酸銨鹽析比較，使用有機溶劑沉淀酶的最大缺點是造成酶部分失活。將來自Botry tis cinerea Pers 的果膠酯酶與聚半乳糖醛酸酶分別用20 %和66 %的丙酮沉淀，將這兩種酶分別純化了5 倍和6 倍。

4.層析

果膠酶經過硫酸銨鹽析和有機溶劑沉淀后，可采用離子交換層析法進一步提純。分離來自Phy tophthora infestans 的果膠酯酶采用了CM-纖維素柱層析法，在pH6.5 條件下以10mmol/ L 磷酸鈉溶液平衡，再用線性梯度的氯化鈉溶液平衡，得到兩個果膠酯酶的峰，分離效果較好。DEAE-纖維素也是分離酶的良好載體，同樣也已被成功地用在分離果膠酶研究上。另外，親和層析在酶的分離中也有一定應用。

5.其他方法

聚丙烯酰胺凝膠電泳作為一種分析手段已被用于檢測制備果膠酶的均一性。分離來自Cytophagejohnsoni i 的果膠裂解酶在pH 8.6 和pH 4.3 都顯示了單一帶，說明已獲得了均一的蛋白。通過圓盤電泳在pH 8.9 對胡蘿卜果膠酶分析走出一條帶說明純化是成功的。等電聚焦法也被應用到純化果膠裂解酶。用等電聚焦法分析來自phoma medicaginisvar pinodella 的果膠裂解酶，得到一條帶，與傳統的圓盤電泳結果一致。Sephadex 凝膠過濾法也是果膠酶純化過程常用的手段之一。選擇不同Sephadex 可以達到分離果膠酶的目的。超離心技術也已被廣泛應用到檢測純化的果膠酶均一性和測定該成分的沉降系數。來自酵母的聚半乳糖醛酸酶經純化后用超離心方法確證其單一的活性成分。由于不同來源的果膠酶成分復雜，給分離帶來一定困難，因此高效液相色譜作為一種快速有效的分析分離方法在酶分離純化上也得到一定的重視與研究.

【應用】^[1][3]

1. 利用果膠酶瓦解植物細胞的細胞壁

1）果蔬汁的生產，果酒的澄清：目前，在大部分的原果汁、濃縮果汁的生產過程中，都在使用果膠酶。 由于各種水果中果膠的含量差別較大，而且果膠質的成分也略有差異，因此，要根據不同品種、不同加工目的來確定果膠酶的酶組成。 由于PG 的專一性對果膠的酯化度要求不如PL 高，在澄清果汁方面往往注重以PG 為主的酶組成，而在提高浸出汁，特別是自流汁方面往往注重使用以PL 為主的酶制劑。

2）天然產物的提取：天然色素如葡萄紫、番茄紅、紫蘇紫、蘿卜紅等均可使用酶法提取，但所用果膠酶不得含有花青素酶等雜酶以免影響某些產品色澤。其次，天然生物活性物質提取物是目前中藥進入國際市場的一種理想方式，出口比例已超過中藥，并呈上升趨勢。可利用果膠酶生產的提取物有：銀杏葉提取物、大蒜油濃縮液、蘑菇濃縮液、人參漿、當歸浸膏、甘草液等。另外，在金耳多糖、香菇多糖、金針菇多糖、山楂葉總黃酮等的提取中也使用了果膠酶。利用酶類提取，不僅可提高萃取率，還可提高純度。另外，在油料萃取方面，按照傳統的生產工藝，菜籽油、棕櫚油、葵花籽油、橄欖油等一般是由正己烷等脂溶性溶劑萃取制得，而正己烷是一種致癌物質。將果膠酶和纖維素酶、半纖維素酶結合使用，可破壞油料作物的細胞壁，便于油料的釋放，從而提高萃取率。由于酶法提取條件溫和，油料中多酚物質和VE 都有所增加，從而提高油料的穩定性。

3）紡織品的生物脫膠：用堿性果膠酶處理，代替堿對棉、麻等織物進行煮練加工和整理工藝，以去除初生胞壁中的果膠物質，在比較緩和的pH值和溫度條件下使處理后的織物手感柔軟，強度高，取代了耗能大、污染嚴重的傳統熱堿脫膠工藝。另外，可避免因微生物處理造成的纖維素的降解。

4）造紙業的生物制漿：造紙工業中的生物制漿與紡織品的生物脫膠類似，都是通過果膠酶等酶處理降解植物纖維原料中的果膠、半纖維素及木質素，使其分散成滿足造紙工業不同要求的束纖維或單纖維，以生產柔軟、均一、有彈性的高品質材料。由于紙漿中高分子果膠帶負電荷，經酶降解至六糖以下即可將其除去，避免了成品紙的靜電現象。

2. 部分分解細胞間質中的果膠物質

1）帶果肉食品的生產：一般常規加工所得到的果肉在必要的高溫處理或機械泵出后，成型顆粒量明顯減少，硬度降低，直接影響了產品品質。果膠質在PE 作用下脫去甲氧基，在鈣離子存在下形成凝膠，從而保持了果肉原有的形狀和硬度。以此為基料的產品有果汁、果凍、果肉酸奶、果肉冰淇淋等。

2）單細胞產品的生產：所謂單細胞產品是指將生物組織進行轉化而形成的完整的單細胞懸液。酶法降解植物細胞間質中的果膠物質產生完整的單細胞懸液的過程稱為浸解作用。在浸解過程中，一方面設法使內源性果膠酯酶滅活，避免細胞軟化；另一方面，用外源果膠酶適度降解胞外果膠及其它成分，避免胞內物質泄漏，降低品質。工藝常用于生產帶肉果蔬汁飲料、乳制品的配料、即食的干燥土豆泥、胡蘿卜泥等食品，以及蘆薈、人參、越橘葉、紅花等美容保健品的配料。

3. 利用果膠酶生產果膠低聚糖

1）以果膠為底物生產低聚果膠：PG 可水解細胞壁中的果膠成分產生聚合度為10 左右的寡聚半乳糖醛酸，后者是植物防御反應的誘導因子，防御作用包括產生有抗真菌活性的抗毒素，抑制蛋白合成的抑制劑等等，而且當endo-PG 與其抑制蛋白結合以后可進一步激活此防御反應，所以PG 在植物致病、抗病中具有雙重作用。 某些中草藥中的藥用成分也與果膠成分有關，如艾草葉中的果膠成分是一種生物活性成分，柴胡根中的抗潰瘍糖類與果膠分子中的RG-II有關，而人參葉中的RG-II也具有抗潰瘍作用，柴胡根中的RG-I能夠促進鼠B 細胞產生I L-6，增進機體免疫力，蒼術根中的果膠片段具有腸道免疫活性。此外，果膠酶解產物還具有抑菌活性，可顯著抑制乳酸菌的生長；還可作為功能性食品的配料。

2）以幾丁質、幾丁聚糖為底物生產低分子寡糖：PG 可水解幾丁質、幾丁聚糖的β-(1，4)-糖苷鍵，得到水溶性寡糖。這類低分子寡糖具有多方面的生理功能，如抗腫瘤、抗菌、增強免疫機能，改善腸道微生物區系的分布，刺激有益菌的生長等。另外，幾丁寡糖可作為保水劑、抗菌劑、植物生長調節劑等應用于農業、食品和化妝品業。

【主要參考資料】

[1] 薛長湖, et al.果膠及果膠酶研究進展. 2005. PhD Thesis.

[2] 賈月, et al. 果膠酶分離純化及分析方法的研究進展.工業微生物, 2005, 35.1: 55-58.

[3] 李琦, et al. 果膠酶應用的研究進展.中國農學通報, 2014, 30.21: 258-262.