9048-46-8 / 牛血清白蛋白的特點與應用

牛血清白蛋白BSA（Bovine Serum Albumin，BSA）大概是生化實驗室最為常見、應用最為廣泛的蛋白質了。雖然小小的BSA并不那么起眼，但是在生化實驗當中，卻常常扮演十分關鍵的角色。

BSA的結構特點

BSA前體蛋白全長607個氨基酸。前體蛋白從N端脫去18個信號肽，以及6個前肽，形成含有583個氨基酸、分子量約為66.5kDa的成熟BSA蛋白。

由于BSA酸性氨基酸數量要多于堿性氨基酸，其等電點約為4.7。BSA在溶液中的表面電荷（Zeta potential）受到溶液pH的影響。當pH大于等電點時BSA帶負電，小于等電點時BSA帶正電。

△BSA表面電荷于pH之間的關系（BSA濃度為15mg/mL）

另外pH還會影響到BSA在水溶液中的分子尺寸。當BSA溶液pH從7.0下降到4.7，等電點附近時，BSA分子尺寸沒有明顯的變化，但是，當pH從4.7下降至3.0時，BSA在水溶液中的粒徑從10nm左右，增加到12.5nm左右。一個可能的原因是，BSA的堿性氨基酸大多數分布在分子內測，當溶液pH小于BSA等電點，堿性氨基酸開始電離，暴露在BSA蛋白質表面。另外，出于同樣原因，當溶液pH降低，BSA的內部疏水基團也會隨之暴露在蛋白表面，而使BSA變得更為疏水。

應用

BSA的應用非常廣泛。在生化實驗中，常將BSA用于維持蛋白穩定性，以及ELISA實驗、western blot，以及磁免疫檢測中的固相封閉。

維持蛋白的穩定性

當蛋白質處于“壓力”的狀態下，如加熱、紫外照射、氧化、剪切力等，蛋白質的空間折疊趨于延展，導致內部疏水位點暴露，發生無定形聚集或者形成高結構化的淀粉樣蛋白，從而失去生物活性。BSA具有良好的熱穩定性，當溫度上升至65度時，其空間結構的變化依然是可逆的。BSA另一個特點是能夠和許多物質形成可逆結合，特別是水溶性較差的物質，如脂肪酸、血紅素、膽紅素、帶負電荷的芳香化合物等，能夠增加其水溶性。因此，BSA是理想的蛋白保護劑。當酶、或抗體等蛋白質發生空間結構變化，BSA能夠與其發生可逆結合，形成穩定的、可溶的高分子復合物，防止蛋白發生無定形聚集。另外，溶液中的BSA能夠與容器表面結合，防止蛋白吸附在容器表面而濃度降低。

如1995年Chang等人發現，蛋白質的穩定性是由蛋白表面的疏水性決定的。當溫度升高時，酶的疏水位點暴露，溶液中的BSA與酶的疏水區域結合，從而維持酶的水溶性，防止發生聚集，有效提高酶的熱穩定性。并且，疏水性越強的保護蛋白，對酶的保護作用越強。

免疫檢測當中固相封閉蛋白

在免疫檢測過程中，需要將抗體固定在固相表面，如微孔板，磁顆粒、聚苯乙烯微球或硝酸纖維膜表面。由于蛋白是一種粘性較大的分子，檢測過程中，樣本中的雜蛋白會與固相表面的疏水位點發生非特異性結合，造成背景干擾。因此，需要將固相表面的多余位點用封閉劑將其封閉，常用的封閉劑，如BSA、酪蛋白、明膠等能夠吸附在固相表面，防止抗體、或者抗原與固相表面發生非特異性結合，降低檢測本底，提高靈敏度。

BSA是一種球蛋白，分子量約為66.5kDa，表面含有大量的氨基和羧基殘基，并且BSA的空間結構能夠隨著溫度、pH、鹽濃度發生變化，是一種柔性分子。作為常見的封閉蛋白，BSA能夠與親水表面、疏水表面，以及活化的共價結合表面，如活化羧基、氨基、環氧基、甲苯磺酰基等結合，抑制非特異性吸附，是一種理想的固相封閉劑。

BSA表面含有大量的羧基、氨基，能夠用于表面的活化基團結合，封閉多余位點，最為常見的是化學發光免疫磁珠偶聯抗體當中的應用。如用EDC活化羧基表面磁珠后，能夠和抗體表面氨基反應，使抗體共價結合在磁珠表面。這一過程需要對多余的活化羧基位點進行封閉，BSA分子尺寸更小，能夠進入到表面抗體間的間隙，并且由于表面含有大量的氨基，與活化羧基反應，封閉多余的活性位點。同時，BSA表面含有大量的羧基，還能夠改善磁珠的親水性。另外，BSA表面含有一定的氨基酸疏水殘基，如丙氨酸、亮氨酸等，也能夠對表面的疏水位點進行封閉。

值得注意的是，Larsericsdotter等人研究發現，BSA在磷酸鹽溶液中，在固相表面吸附更為緊湊，形成的結構也更為穩定。這是因為，磷酸鹽與BSA上的甘氨酸和精氨酸結合，能夠消除結構性靜電排斥。因此BSA在磷酸緩沖液中結構更為穩定，在固相表面具有更高的結合效率。

BSA的隱患

采用BSA作為穩定劑和封閉劑一個最大的問題是批次之間的差異。作為生物來源的蛋白質，不同廠家的BSA規格不一致，同一廠家，不同批次之間的差異，都會給實驗結果帶來巨大的差異。為了保證實驗的一致性，國內大多數廠家都選用進口的BSA，如Biowest，Sigma，Thermofisher，Merck，Bovogen，Proliant等。

同時不少廠家都推出了無蛋白穩定劑，以及化學合成的封閉劑，作為BSA替代。如Synblock系列，以及JSR推出的Blockmaster系列等。其中JSR公司利用獨有技術，開發了一系列的聚合物型封閉劑，適用于磁珠封閉。CE510/CE210采用生物相容性極高的柔性分子聚乙二醇（PEG）作為骨架，在PEG一端修飾一段寡氨，能夠和磁珠表面活化的羧基、或者疏水位點發生反應，固定在磁珠表面，從而起到封閉的作用。同時，由于PEG是極強的親水性柔性大分子，能夠增加磁珠表面的水化層，有效降低磁珠的沉降速率，并且對表面修飾的抗體起到支撐作用。

BSA除了能夠用作蛋白穩定劑、固相封閉劑之外，還可以作為小分子的載體，如通過把熒光分子修飾在BSA表面，再將熒光-BSA與抗體偶聯，在增加熒光強度的同時，避免由于抗體的過度修飾而導致抗體失活。

BSA是生化實驗室最常用的蛋白之一，而實驗中，可能因為它過于常見、過于平凡而忽略了它的重要性。本文對BSA的分子結構，氨基酸數目，以及BSA維持熱穩定性功能，免疫檢測封閉功能進行了基本的描述。如何選擇合適的BSA，如何設定BSA的質控，以及如何最大程度的發揮BSA的性能，對于一個實驗室來說也是一個大的課題。