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硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)系從動物軟骨組織中提取、純化所得的酸性粘多糖。硫酸軟骨素有A,C,D,E,H和K等不同結構,自然界中的硫酸軟骨素多存在于動物的軟骨、喉骨、鼻骨(豬含41%)、牛、馬中膈和氣管(含36%一39%)中,其他如腿骨、韌帶、皮膚、角膜等組織中也含有。魚類軟骨中含量很豐富,如鯊魚骨中含50%~60%,結締組織中含量很少。
腔腸動物、海綿動物、原生動物也含有硫酸軟骨素。海洋魚類如角鯊目和鰩形目軟骨含有大量特征的硫酸軟骨素D,以軟骨硫酸粘蛋白形式存在,水解后生成硫酸軟骨素和蛋白質。灰白色固體粉末。主要作為醫藥品,少量用作食品添加劑和化妝品原料。各種硫酸軟骨素的生理作用和藥理作用有些差異,但未完全了解。其藥用范圍涉及心血管、神經、消化和泌尿系統,臨床上用于治療多種病疾。
CS臨床上主要用于治療神經痛、關節炎、耳鳴以及促進潰瘍愈合和防治高血脂癥等。隨著對其生理功能及生化性質的深入研究,發現它具有抗凝血和防止血管硬化等活性,對冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有較好的療效,對神經細胞、腎細胞等具有保護作用,因此在國外是很流行的保健品添加劑。近年來,CS大量出口美國或歐洲,已成為出口量最大的生化醫藥產品之一。
硫酸軟骨素是一種酸性黏多糖-糖胺聚糖,有多種異構體,目前藥用的主要是A和C異構體,它們均由D-葡糖醛酸、N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯為單位組成。按化學組成和結構的差異,又可將硫酸軟骨素分為A、B、D、E、F、H等多種,其中B、F、H分子中含L-艾杜糖醛酸。一股硫酸軟骨素約含50~70個雙糖基本單位,硫酸角質素約含15~30個雙糖基本單位,鏈長不均一。
硫酸軟骨素為白色粉末,無臭無味,吸水性強,易溶于水而成黏度大的溶液,不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑,其鹽類對熱較穩定,受熱達80 亦不被破壞。游離硫酸軟骨素水溶液遇較高溫度不穩定,主要是乙酰基被水解,從其結構上脫落下來。在酸性溶液中易水解成單糖體或較小的多糖體。
硫酸軟骨素的提取方法有酶解、堿法、超聲波法和中性鹽法等;其分離純化有乙醇沉淀法、離子交換色譜法、季銨鹽配合法、吸附法和纖維素分離法等。國內普遍采用稀堿和濃堿的提取法,國外報道用稀堿稀鹽綜合提取法。這些制備工藝一般都要經過酶解和活性炭或白陶土等處理。酶用高倍胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無花果蛋白酶等,去糖原時用淀粉酶。
先將軟骨在80 ℃煮4~6 h,然后按原料(干重)與2%NaOH 的比例為l:6.25的量加入NaOH,室溫提取1.5 h,然后用HC1調pH到6~6.5,雙層紗布過濾;留下濾液,濾渣再以1:0.12的比例加入2%的NaOH,于40 ℃下提取l h,再用雙層濾布過濾;棄濾渣,取濾液。合并2次濾液,并測量體積待用。
濾液調節pH到8.0~9.0,按濾液與胰酶1 000:0、5的比例加入胰酶,于40~50℃水解l h后,再按1 000:0.5的比例加入胃蛋白酶,40~50 oC水解1.5 h。過濾后加入高嶺土和活性炭吸附。用氯仿反萃取法萃取濾液,留水層。調水層pH至6.8~7.2,再加入2.5倍體積的95%1~2上乙醇沉淀,即得硫酸軟骨索。
該方法的實驗流程與稀堿酶解法基本一樣,只是在堿解這一步增大了堿的濃度。高華㈣等應用該法生產了硫酸軟骨索,研究得出優化的試驗條件。堿提取的最佳條件是按軟骨與1 mol/L NaOH溶液質量比1:2混合,溫度控制在45℃,攪拌提取2 h。
復合酶酶解工藝的適宜條件為按復合蛋白酶與料液1:1 000的質量比加入蛋白酶,控溫40~50 ℃,保持溶液pH8.5-9 0,水解4h。在最佳實驗條件下,得到硫酸軟骨素為白色粉末,產品純度達95.2%,收率為32.6%。。
用以NaOH堿化的氯化鈉溶液從動物氣管中提取硫酸軟骨素。該工藝是取處理后的動物氣管用3~4 mol/L 的NaC1溶液浸沒,加50%的NaOH調pH 為l3左右,室溫間歇攪拌,提取10~17 h,過濾;濾渣再用等量3~4 mo1/L的NaC1溶液
浸泡提取1次,合并2次提取液。加入稀鹽酸調pH為7左右,在80~10o℃水解2060 min,冷卻。水解液過濾,濾液用稀鹽酸調pH為2~3,靜置,過濾。濾液在攪拌下,用堿調pH為6~7,在上述溶液中,邊攪拌邊加入無水乙醇,使溶液中乙醇濃度控制在50%~70%,可以得到硫酸軟骨素沉淀。合適的操作條件為2次浸泡時間總和25~30 h,水解時間20~40 min,乙醇最終濃度為60%~70%。
用復合酶解法提取硫酸軟骨素。把豬肋、喉、氣管等軟骨預處理后,以骨粉1:3的比例加入去離子水,加入原料量1%的復合酶,于55℃攪拌酶解12~15 h。復合酶水解液用HC1調pH7.5,加入2%的醋酸鈉溶液,攪拌溶解后,升溫到85℃,保溫20min,過濾去殘渣。濾液加入胰酶酶解。
經酶解后的酶解液在85℃下維持15min,過濾,乙醇沉淀,F燥磨粉后得成品。影響該工藝水解反應的因素為酶解溫度、pH值與加酶量,利用正交試驗得出優化條件為溫度50 ℃、pH8.6~8.9、加酶量0-39 L,收率達17.84%。采用全新的雙酶酶解藝和中空纖維超濾等現代技術生產硫酸軟骨素,由于酶作用專一性強的特點,質量穩定、收率高,產品顏色潔白,生產周期較短。
將鯨魚軟骨絞碎,加1 mol/L的NaOH溶液浸泡,40 ℃保溫水解2 h或加pH7.5的水浸泡,用蛋白酶55℃保溫水解20 h,再加HE1中和近中性,過濾,調整濾液中NaC1濃度達到0.5 mol/L后,將溶液通過Amberlite IRA-933刪離子交換樹脂柱,吸附完畢,用0.5 mol/L的NaC1液洗滌,再用1、8 mol/L的NaC1液洗脫,流速2 L/h,洗脫液脫鹽,乙醇沉淀,離心,收集沉淀,真空干燥,即得成品。
應用此工藝制得的硫酸軟骨素樣品,經紙電泳檢查為單一區帶,抗原物質試驗結果為陰性,含硫量為7.2%。其優點是酶水解或稀堿水解與樹脂交換技術相結合,保證了硫酸軟骨素分子不降解,解決成品純度的問題。方法簡便,收率高,是一種較有實用價值的制備方法。
利用超聲波法制備硫酸軟骨素,其原理是在堿性條件下蛋白質易離解和超聲波的熱學機制叮促使蛋白質快速解離而達到去雜蛋白的目的,升溫(85~90℃)均町使解離的蛋白質變性吸附到白陶土上,從而使硫酸軟骨素蛋白質分離,提高產品質量。以豬喉骨為原料,在對其進行預處理后,使用超聲波手段進行稀堿抽提,浸出液再用超聲波二次處理使雜蛋白解離,經白陶土和活性炭去雜脫色,酒精沉淀后,干燥即得合格的硫酸軟骨索,收率為8%。
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